液相色谱法
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液相色谱法名词解释：
（liquidchromatography）用液体作为流动相的色谱法。
简史1903年俄国科学家M.C茨维特用于分离叶绿素所用的方法即液相色谱法。由于当时采用的柱填料颗粒大（100～150微米），移动相只借助于重力作用缓慢地流过色谱柱，因此分析速度慢，分离效率低，被称为经典液相色谱。20世纪60年代初期，由于生物和环境科学等方面的迫切需要，在气相色谱（见气相色谱法）理论和技术发展的基础上，液相色谱才获得了新的飞跃。液相色谱动力学、热力学过程和最佳条件选择的理论研究，以及细粒度填料（3～10微米）、高压输液泵、梯度淋洗技术、各种高灵敏度检测器的发展，使液相色谱在分析速度、分离效率和检测灵敏度三方面都达到了与气相色谱相媲美的程度。为了与经典液相色谱相区别，现代液相色谱又称为高效液相色谱。
原理高效液相色谱的基本原理与气相色谱一致，不同点在于：液相色谱中溶质的扩散系数为气相色谱的万分之一到十万分之一；液相色谱所用流动相的粘度比气相色谱大100倍左右；液相色谱的流动相的组成对柱内吸附分配平衡的影响很大，常成为选择分离过程最佳条件的主要因素，而气相色谱的流动相对分离过程的影响一般是可以忽略的。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱，液液色谱和键合相色谱。目前应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微粒硅胶为基质的键合相色谱。
按固定相和流动相之间相对极性的大小分类，高效液相色谱又分为正相色谱和反相色谱。正相色谱是以硅胶或极性键合相为填料，以非极性溶剂为冲洗剂的色谱法。其特点是：①溶质的保留值随其极性的增大而增大，随冲洗剂极性的增大而减小；②溶质的保留机理是由固定相的极性吸附点与溶质分子的极性基团（亲水性基团）相互作用，以及溶质与冲洗剂的相互作用所控制；③流动相的极性通常小于固定相的极性。
正相色谱主要用于族分离和异构体分离（包括几何异构体和光学异构体）。由于一般正相色谱所用冲洗剂是易挥发的有机溶剂，分离后的馏分易于浓缩和富集，以便进一步进行定性分析，这对环境分析中多核芳烃的检测和药物化学、生化分析中的脂类、甾族化合物、维生素等结构相似的化合物分离特别有利。
一般认为，正相色谱的保留机理是吸附机理。已有许多理论定量处理这一吸附保留分离过程，例如L.R.斯奈德的顶替吸附理论、R.P.W.斯科特的多层吸附理论、D.E.马丁的液体晶格统计力学理论和卢佩章的顶替吸附－液相相互作用统计热力学理论。后者不仅适用于液固吸附色谱，也适用于键合相色谱和弱酸、弱碱、两性化合物的分离。
反相色谱是由极性较小的物质作固定相，流动相的极性则较大。反相色谱常用的固定相是以硅胶为基质的烷基键合相，尤以十八烷基键合相应用最广。冲洗剂多用乙腈－水或甲醇－水体系。反相色谱的特点是：①能使分子量和分子极性相差较大的各种样品组分得到分离；②离子型样品可通过第二化学平衡达到有效分离，例如在含水流动相中加入少量离子对试剂，或控制流动相的酸碱度；③在流动相中加入少量添加剂，能使几何异构体和光学异构体获得分离；④固定相表面非极性分子吸附力小，色谱柱系统能迅速达到平衡，易于操作。
反相色谱的保留机理仍在研究中，一般认为反相色谱的保留作用是由疏水性（非极性）作用力起主导作用。主要有三种观点：①液-液分配过程；②与正相色谱相似的吸附过程，吸附力主要为比正相色谱的极性作用弱得多的色散力所贡献，并应考虑液相分子间的相互作用力；③键合相分子和流动相中有机组分形成新的固定相，溶质分子在两相间进行分配。
装柱方法高效液相色谱柱填料的发展极为迅速，60年代初发展的薄壳填料的柱效仅每米1000～3000理论塔片数。到60年代末，球型和无定型微粒硅胶（3、5、10微米等）以及以微粒硅胶为基质的键合相填料的柱效可达每米5万到十几万理论塔片数。键合相的种类也日益增多，主要有氰基、氨基、醇基、烷基（包括C18、C16、C14、C12、C10、C8、C2等系列），硝基、苯基等。此外还有有机胶填料。
高效液相色谱柱是细粒度填料制备和高压淤浆装柱技术相结合的产物。由于高效液相色谱填料粒度细，其表面活性强，采用常规气相色谱的“干装技术”，不能得到紧密均匀的柱床。高压淤浆装柱是把细粒度填料制成匀浆后，以高于500大气压的压力装入柱中而获得高效柱。
高效柱的内径一般为4.6毫米左右。细内径柱越来越受到人们的重视，2毫米细内径柱已商品化，1毫米内径甚至0.20毫米内径（又称微型填充柱）也有许多报道。细内径高效柱的使用大大降低了冲洗剂和样品的消耗量，但对柱外效应则要求越小越好。
设备基本部件是输液泵、色谱柱和检测器。为了适应多功能的要求，还可采用梯度冲洗装置、进样装置、馏分收集装置、恒温控制装置、数据处理装置和微机控制系统等。（参见彩图插页第40页）
输液泵它的功能是将冲洗剂（流动相）在高压下连续不断地送入柱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。输液泵有多种类型，按排液性质的不同可分为恒压泵和恒流泵；按工作方式的不同又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵。前两种为恒压泵，后两种为恒流泵，往复柱塞泵是高效液相色谱仪上采用最广的一种（图1）。
梯度冲洗装置梯度冲洗又称溶剂程序，它是指在色谱分离过程中，冲洗剂的组成按一定的规律连续地改变，它的作用与气相色谱中的程序升温相似。液相色谱中冲洗剂的极性变化直接影响样品组分的保留值，因此，梯度冲洗可改善复杂样品的分离度，缩短分析周期和改善峰形。梯度冲洗装置可分为低压梯度（又称外梯度）装置和高压梯度（又称内梯度）装置。低压梯度装置中，在常压下将冲洗剂按预先规定的比例混合后，再由输液泵输入色谱柱。高压梯度装置中，由两台输液泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱，这是泵后高压混合形式。图2是目前比较广泛采用的低压梯度装置，可实现三元梯度冲洗。电磁比例阀的开关频率由控制器控制，改变控制器程序即可得到任意混合浓度的梯度曲线。
进样装置常用的进样方式有三种：
①注射器隔膜进样，适合于100千克力/厘米2以下的中、低压范围使用，是可获得最高柱效率的一种进样方式，但进样重复性不佳。
②阀进样，一般都是采用平面阀，有定体积进样和可变体积迸样两种类型，进样量可从0.02微升到数百微升。这种进样方式有较好的定量重复性，并适用于100千克力/厘米2以上的高压进样，但柱效有所损失。
③自动进样器，由一个定体积进样阀和一个多点采样盘组成，由程序器或微处理机控制，适合于多种样品重复分析和制备分离。
检测器主要有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器。紫外吸收检测器使用最广，它有三种结构型式：单波长式、多波长式和紫外-可见分光式。
单波长紫外检测器（图3）具有灵敏度高、稳定性好、结构简单、使用维护方便等优点。多波长式和紫外-可见分光式吸收检测器扩大了波长工作范围，而使应用范围显著扩大，并可获得更好的选择性。
数据处理装置和微型计算机控制系统现代先进的高效液相色谱仪均配有计算机或积分仪，以自动处理数据、作图并打印出分析报告。整机仪器的操作包括冲洗剂选择、流速、柱温、检测器波长选择以及进样、梯度冲洗方式等，都由微型计算机控制。
应用举例高效液相色谱法在高分子化合物、对热不稳定的化合物、生物活性物质和离子型化合物等方面的分离分析中显示出其特殊的优越性。图4为用硅胶作载体（又称担体）分离血清中维生素E的异构体所得的色谱图。由色谱峰可以测出维生素E的异构体的结构（结构式如右），R1和R2都是CH3时，是α-维生素
E；R1为CH3，R2为H时，是β-维生素E；R1为H，R2为CH3时，是γ-维生素E；R1和R2都是H时，是δ-维生素E。图5为用反相色谱法分离氨基酸混合
物时所得的色谱图。
图5用反相色谱梯度冲洗法分离氨基酸混合物的色谱图各色谱峰所对应的化合物：
1PTH-羟基丙氨酸（PTH为己内酰苯硫脲）2PTH-天冬氨酸3PTH-谷氨酸4PTH-天冬酰胺5PTH-丝氨酸6PTH-谷氨酰胺7PTH-苏氨酸8PTH-甘氨酸9PTH-组氨酸10PTH-丙氨酸11PTH-酪氨酸12PTH-脯氨酸13PTH-蛋氨酸14PTH-缬氨酸15PTH-精氨酸16PTH-色氨酸17PTH-苯丙氨酸18PTH-异亮氨酸19PTH-赖氨酸20PTH-亮氨酸21PTH-正亮氨酸
以疏水性作用为主要作用力的疏水色谱法已广泛用于蛋白质混合物的纯化和分离、分析中。其最大优点是在蛋白质分离过程中，高浓度的盐组分不会改变蛋白质分子的几何构型和生化活性。
（张玉奎林从敬）