牛膝提取物植物提取(牛膝有效成分（ABE）干预BMSCs路径治疗骨关节炎获得重大突破)

Posted 2023-06-02

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牛膝提取物植物提取(牛膝有效成分（ABE）干预BMSCs路径治疗骨关节炎获得重大突破)

作者：马笃军课题组

广州中医药大学第四临床医学院

骨性关节炎（OA）是中老年人常见的慢性关节疾病，涉及关节软骨、滑膜、软骨下骨等关节组织，主要表现为关节疼痛、僵硬及活动受限。OA的病因尚未明确，年龄、性别、肥胖、遗传等是发病的高危因素。OA的治疗目前市场上还没有有效的手段。

马笃军课题组通过对既往治疗OA文献的数据挖掘和结合广东省名中医彭力平教授治疗膝骨病的临床经验总结，发现怀牛膝是治疗OA频率最高的药物，牛膝独特的“标本兼治”和“引经”作用，使我们设想，牛膝的“强筋”功效，应包括对关节软骨的防退变、促修复功能。牛膝的化学成分主要有多糖类、皂苷类、甾酮类、黄酮类及多种微量元素等，针对关节疾患的主要药理作用包括抗炎镇痛，还具有促进软骨细胞增殖、促进骨髓干细胞归巢、降低软骨细胞凋亡率（通过影响 PI3K/AKT 通路）等作用。基于前期研究，马笃军课题组通过系列的分子生物实验、组织工程实验、动物实验及临床实验反复的验证，获得了治疗OA的重大突破。

怀牛膝：性味辛、苦，平。入肝、肾、膀胱经。具有活血化瘀，利关节，引血下行，补肝肾的功效。

一、基于CRISPR/Cas9技术探讨牛膝有效成分促进BMSCs软骨分化的网络机制研究

以关节软骨损伤为核心病理改变的骨关节炎疾病，自然修复软骨组织缺乏正常力学性能，尚无理想药物和疗法修复软骨，成为治疗难点。骨髓间充质干细胞（BMSCs）能优于其他来源细胞分化为软骨细胞，中药干预下的干细胞软骨分化具有特色和优势，但促软骨分化的研究较少。前期研究发现，牛膝含药血清培养BMSCs能促使其明显表达软骨细胞标志性Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白，表明BMSCs向软骨细胞分化，但作用机制不清楚。马笃军课题组通过兔BMSCs体外培养进行BMSCs和牛膝含药血清与经典软骨诱导剂对照培养，促使BMSCs体外诱导软骨形成。采用蛋白组学iTRAQ技术、基因组高通量测序筛选牛膝诱导软骨分化主要差异蛋白、基因及作用信号通路，用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑特异靶点RAB39B基因验证结果，揭示牛膝对BMSCs体外扩增和软骨细胞定向分化的机理。证实牛膝善“补肝肾、强筋骨”的中医理论，为临床解决关节软骨损伤、退变的修复提供了理论依据（见图1-7）。

图1 CRISPR/Cas9 的结构和作用机制图

图2骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果

图3 LentiCRISPRv2GFP 载体信息图谱

图4 RAB39B 敲除慢病毒感染兔骨髓间充质干细胞 (×100)

图5 qRT-PCR 检测 CRISPR/Cas9 系统基因敲除 RAB39B 后骨髓间充质干细胞中 COLⅡ、COLⅩmRNA 表达

图6 Western blot 检测 CRISPR/Cas9 系统基因敲除 RAB39B 后骨髓间充质干细胞软骨分化相关通路 RHOA、 LIMK、 Sox9 蛋白表达变化

图7 基因编辑治疗骨关节炎的路径假想图

二、牛膝有效成分干预BMSC-Exos对 OA模型兔局部骨组织超微结构及炎症小体的影响

观察牛膝醇提物含药血清培养的骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSC-Exos）对实验兔骨关节炎模型关节局部骨组织超微结构及炎症小体的影响。方法：将20只健康实验兔按照随机数字表法分为空白组、模型组及牛膝醇提物低、中、高剂量组，每组4只，分别予等量蒸馏水及牛膝醇提物低、中、高剂量灌胃1周后采血制备牛膝醇提物含药血清，用牛膝醇提物不同浓度含药血清连续培养骨髓间充质干细胞7 d，在第7天时从骨髓间充质干细胞上清液中提取外泌体，再将外泌体通过关节穿刺的方法注射到不同组别兔膝骨关节炎模型内，1次/周，连用3周，第6周后进行膝关节软骨组织病理HE染色、关节活动度评分及关节粘连改善度评分，用microCT检测膝关节局部周围骨组织超微结构及骨量，采用qRT-PCR检测滑膜组织中炎症小体关键分子NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-kB mRNA表达水平。结果：实验兔膝关节腔注射外泌体第6周后，与模型组比较，低、中、高剂量组兔膝关节活动度和粘连改善度评分均明显升高（P＜0.01），且与剂量呈正相关。模型组兔膝关节软骨基质染色变浅，软骨细胞数量明显减少，关节面凹凸不平，血管入侵潮线结构；低、中、高剂量组兔膝关节软骨基质染色逐渐恢复正常，软骨细胞数量较模型组增多，软骨细胞呈卵圆形，关节面恢复平整，潮线结构依次恢复正常。microCT检测提示，与模型组比较，低、中、高剂量组兔膝关节的Mean、BMD、Conn.Dn.、BV/TV均明显升高（P＜0.05），BS均明显降低（P＜0.05），而BS/BV、BS/TV、Tb.N、Tb.Sp、DA组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05），其中Mean、BMD、Conn.Dn.、BV/TV、BS与剂量呈相关性。qRT-PCR检测结果显示，模型组兔滑膜组织NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-kB mRNA相对表达量均明显高于空白组（P＜0.01），低、中、高剂量组兔滑膜组织NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-kB mRNA相对表达量均明显低于模型组（P＜0.05），且与剂量呈正相关。结论：牛膝醇提物能改善OA模型局部骨组织骨含量及骨微结构，能降低炎症小体通路关键分子NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-kB mRNA表达，其作用机理有待进一步研究。

图8 外泌体（exosomes）提取与鉴定

图9 各组兔膝关节周围骨组织microCT检测超微结构图

图10 各组兔膝关节滑膜组织中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、Toll4 mRNA、NF-kB mRNA相对表达量比较（x(—)±s，n=8）

三、牛膝有效组分通过花生四烯酸途径减轻骨关节炎的炎症反应

Achyranthes bidentate is a common traditional Chinese medicine (TCM) used in treating osteoarthritis (OA). The compatibility between effective components has now become a breakthrough in understanding the mechanism of TCM. This study aimed at determining the optimal compatibility and possible mechanism of Achyranthes bidentate for OA treatment. Results showed that the adhesion score of the OA group is higher than NC group, and showed a trend of down-regulation in the intervention group. The CHI3L1 and IL-1β in joint fluid of the OA group was significantly increased compared to the sham operation group (NC group). Group G, I, and L exhibited significantly down-regulated CHI3L1, while groups C, F, I, K, and L exhibited reduced IL-1β. Joint adhesion, damage in cartilage, and synovial tissue was found in the OA model, cartilage tissue was found recovered in groups I, J, and L, and synovial tissue was recovered in group G, I, and L. Thus, group I and L were chosen for metabolite analysis, and indole-3-propionic acid was slightly up-regulated, while koeiginequinone A, prostaglandin H2, and 1-hydroxy-3-methoxy-10-methylacridonew were down-regulated in group I and L. According to functional analysis, the arachidonic acid (AA) metabolic pathway is enriched. Down-regulated expression of vital proteins in the AA metabolism pathway, such as PGE2 and COX2 in group I and L were verified. In conclusion, Hydroxyecdysone, Oleanolic acid, Achyranthes bidentata polysaccharide at a compatibility of 0.03-μg/mg, 2.0-μg/mg, 20.0-μg/mg or 0.03-μg/mg, 2.0-μg/mg, 10.0-μg/mg, respectively, may be the optimal compatibility of Achyranthes bidentate.

图注：根据m/z值对牛膝的3种成分进行了购买和鉴定。质谱检测牛膝单体成分，B-蜕皮甾酮分子式为C30H48O3, m/z值为11.7(图1A);齐墩果酸的分子式为C27H44O7, m/z值为25.19(图1B)。

图11 牛膝有效成分分子结构图

图12 牛膝3种单体不同配伍对治疗后关节粘连及炎症水平的影响

图13 牛膝3种单体I组和L组差异表达代谢物的层次聚类分析

图注：A.对差异表达代谢物进行富集分析发现，I组花生四烯酸(AA)代谢途径显著富集;B.ELISA检测大鼠血清样本中验证PGE2的表达，经治疗后PGE2表达显著降低;C.WB检测花生四烯酸代谢通路关键蛋白COX2在软骨组织中的表达情况，结果显示，经治疗后COX2表达降低;D.WB统计分析结果

图14 牛膝有效成分对花生四烯酸代谢途径影响的研究

四、牛膝有效成分产品的临床转化成果应用

牛膝醇提物是牛膝有效成分的浓缩物，纯度高，吸收快，是修复软骨病变的好材料。基于前期研究，我们课题组开展了牛膝醇提物治疗骨关节炎的系列研究，分别从分子生物学、细胞学层面实验再到动物实验和人体实验层面，证实了牛膝醇提物能显著改善骨关节炎的滑膜粘连、减轻关节液的炎症物质和促进软骨细胞修复的有效性。

近7年来，我们科开展了牛膝醇提物中药定向透药临床治疗项目（已申请院内制剂），表明了牛膝醇提物能显著减轻关节肿胀和降低关节疼痛，效果显著，在临床治疗中获得了患者一致好评。

图15 牛膝醇提液的院内制剂包装

图16 牛膝醇提液配合透药仪给骨关节炎患者治疗实践图

马笃军中医药治疗骨关节炎课题组团队主要成员：马笃军、彭力平、蒋顺琬、王立新、余阗、余伟吉、高坤、廖州伟、李亨、谢辉、吴克亮、李媛、赵静、钟静、刘乐诗、佘锐豪，等。课题组博士生导师1人、硕士生导师3人，由高级职称7人、中级职称4人、初级职称1人、研究生4人组成，其中博士学位4人、硕士学位7人。

基金来源：

[1]国家自然科学基金项目（项目编号：81804124）：基于CRISPR/Cas9技术探讨补肝肾强筋骨中药促进BMSCs软骨分化的网络机制研究

[2]广东省自然科学基金（项目编号：2018A0303130138）：基于AMPK/Wnt/MAPK信号通路串话研究牛膝醇提物对骨关节炎软骨修复的机制研究

参考文献：

[1]Li Z,Ma D*,Peng L*,Li Y,Liao Z,Yu T.Compatibility of Achyranthes bidentata components in reducing inflammatory response through Arachidonic acid pathway for treatment of Osteoarthritis.Bioengineered.2022,13(1):1746-1757.

[2]马笃军,彭力平,蒋顺琬,廖州伟,佘锐豪,钟静.牛膝醇提物干预BMSC-Exos对 OA模型兔局部骨组织超微结构及炎症小体的影响[J].中医药导报,2022,28(1):12-18.

[3]马笃军,彭力平,周紫琼,赵静,朱厚均,蒋顺琬,钟静,佘锐豪.基于CRISPR/Cas9技术编辑RAB39B基因对骨髓间充质干细胞软骨分化的影响[J].中国组织工程研究,2022,26(19):2978-2984.

[4]马笃军,华树良,彭力平,蒋顺琬,曹亚飞,高坤,王立新,莫益斌.牛膝醇提物对实验兔膝骨关节炎模型AMPK/Wnt/MAPK信号通路串话的影响[J].中医药导报,2021,27(7):16-21,26.

[5]马笃军,彭力平,陈锋,等.基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义 [J]. 中国组织工程研究, 2021,25(2):298-303.

[6]Ma D,Li Y,Xiao W,Peng L*,Wang L,Liao Z,Hu L.Achyranthes bidentata extract protects chondrocytes functions through suppressing glycolysis and apoptosis via MAPK/AKT signaling axis. Am J Transl Res 2020;12(1):142-152

[7]Ma D,Yu T,Peng L*,Wang L,Liao Z,Xu W.PIM1, CYP1B1, and HSPA2 Targeted by Quercetin Play Important Roles in Osteoarthritis Treatment by Achyranthes bidentata[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Volume 2019,Article ID 1205942,10 pages:https://doi.org/10.1155/2019/1205942