点突变质粒的构建PCR的酶(质粒构建问题频出?一篇文章帮你扫清所有障碍)

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篇首语:不操千曲而后晓声,观千剑而后识器。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理,主要介绍了点突变质粒的构建PCR的酶(质粒构建问题频出?一篇文章帮你扫清所有障碍)相关的知识,希望对你有一定的参考价值。

点突变质粒的构建PCR的酶(质粒构建问题频出?一篇文章帮你扫清所有障碍)

研究一个蛋白质的第一步是拿到它准确的基因序列,有了基因序列,我们就可以构建合适的质粒,表达出所需要的蛋白。

质粒构建,英文名为plasmid construction。选定的目的外源基因(DNA)先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段,再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接,转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

图一:质粒构建流程示意图

1、如何选择载体?

载体通常分为克隆载体(Cloning Vector)与表达载体(Expression Vectors)两种。

克隆载体大多是高拷贝载体,能够将外源基因与克隆载体的质粒连接,导入原核细菌内,进行大量复制克隆。主要用途是保存目的基因片段。

在选择克隆载体时应注意:

① 具有自主复制能力,拷贝数高;

②携带易于筛选的选择标记;

③含有多种限制酶的单一识别序列,以供外源基因插入;

④载体应尽可能小(<15kb),便于导入细胞和进行繁殖;

⑤使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内,在宿主体内不进行重组,不发生转移,不产生有害性状,并且不能离开工程宿主自由扩散。

表达载体是为了使插入的外源DNA序列转录、翻译成多肽链而进行特殊设计的克隆载体。它含有特定的表达系统元件,即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号

根据表达的类型,表达载体可分四类:

非融合型表达载体,如PKK223-3;

分泌型表达载体,如PINⅢ-ompA1;

融合蛋白型表达载体,如PGEX;

包涵体型表达载体,如pBV220。

图二:基因片段选择

2、引物设计中的规则

运用PCR扩增目的基因的过程中,引物设计十分关键,以下是需要注意的:

① 引物长度最好在18-30bp左右,常用的长度是 20-22bp;

②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右,两条引物间 Tm 值要保持接近,相差最好不要超过 5°C;

③GC 的含量标准通常为 40%-60% 或45-55%;

④引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基,避免形成发卡结构或形成引物二聚体;

⑤引物的3' 端要避免出现连续重复的碱基,如 GGG 或 CCC ,这会导致错配的发生,最后一个碱基最好是 G 或 C;

⑥在引物的 5′ 端添加酶切位点时(在不影响扩增的特异性的前提下),根据酶切位点序列,需要添加不同种类和数量的保护碱基,通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求;

⑦上下游引物最好加入不同的酶切位点,相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象,影响基因序列的正常表达。

3、PCR扩增中常见的问题

扩增基因的过程并不困难,但未必能保证百分之百的成功率。

如结果出现引物二聚体、非特异性条带(大小不对)的现象,可以通过降低模板和引物的浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量,提高退火温度,来提高扩增特异性。

若出现凝胶条带弥散状态,多为模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等原因。

长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率,选用高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶也很关键。

4、其他问题

在操作酶切连接的步骤时也要定性定量,保证酶活性充足,例如:双酶切尽可能选择同种缓冲buffer,一般用量40U单位以上(用量不超过总体积1/10),保证酶切过程充分;可根据 目标片段量(ng)=(载体量(ng)×目标片段长度(kb))/(载体DNA片段长度(kb))×目标片段和载体的摩尔比(1:3-1:8)计算出目标片段和载体的加入量,提高连接效率。

构建好的载体放入感受态细胞中转化(TOP10、DH5α、BL21等,感受态细胞在使用时尽可能保证新鲜,避免反复冻融,冰上孵育和热激时间应严格控制),经抗性、菌落PCR、酶切、测序等多道程序验证,确定是否转化成功,最终获得正确的重组克隆基因片段。

5、如何选择正确的菌株和载体(详见文末列表)

公司简介

「青云瑞晶」是一家专业的CRO(研发服务提供商)。公司拥有高标准的实验室、先进的设备,和丰富经验的博士硕士研究人员,在结构生物学,药物固态研究和新材料结构表征,三个业务板块,为客户提供最先进的解决方案。

公司自主开发了国际领先的MicroED结构解析平台,结合冷冻电镜单颗粒(CryoEM-SPA)及同步辐射单晶X射线衍射(XRD),为客户解决难点问题。

E coli strain list

No.

strain

annotation

Resistant

1

BL21 (DE3)

最常用的

No

2

Rosetta (DE3)

稀有密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA

Cl

3

Rosetta2 (DE3)

稀有密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG

Cl

3

Origami 2 (DE3)

二硫键及稀有密码子

StrR,Tet

4

C41 (DE3)orC43 (DE3)

疏水性蛋白

No

5

Arctic (DE3)

TPN30 & TPN60 分子伴侣

Tet,Cam

6

Tuner(DE3)

通过IPTG精确控制表达量, 0.1mM IPTG

No

7

BL21 (DE3) pLysS

降低毒性蛋白的本底表达

Cl

8

Rosetta(DE3) pLysS

降低毒性蛋白的本底表达,稀有密码子AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, 和GGA

Cl

9

BL21(DE3) del-slyXD

BL21(DE3) knock out slyXD

No

10

B834(DE3)

Met缺陷菌株

No

11

T7 pLys Y

具有抗T1噬菌体感染能力

Cl

12

BL21star(DE3)



13

origamiB(DE3)

二硫键

KanR,TetR

14

Origami 2 (DE3) pLysS

Origami 2 (DE3)的基础上加pLysS抑制本地表达。

Cl,StrR,Tet

15

Dh5α

克隆菌株

No

16

Dh5α-T1

具有抗T1噬菌体感染能力

No

17

Dh10bac

Bacmid 制备

Tet,gentamicin

18

BL21-Gold(DE3)

可以同时用作蛋白表达菌株和质粒克隆菌株

No


Plasmid list

名称

长度

抗性

特殊性能

PAO815

7709 bp

Amp

酵母表达

pAxCAwt

44741 bp

Amp

腺病毒表达

pAxcw

42410 bp

Amp

腺病毒表达

pAAV-MCS

4.7 kbp

Amp

哺乳动物细胞表达

pBacPAK8

5.5 kbp

Amp

杆状病毒表达

PBI121

13.0 kbp

Kan

植物细胞表达

pBV220

3665 bp

Amp

原核表达

pCAMBIA 1300



植物细胞表达

pCAMBIA 1301

11837 bp

Kan

植物细胞表达

pCAT3-Basic

4047 bp

Amp


pcDNA 3

5446 bp

Amp

哺乳动物细胞表达

pcDNA 3.1(+)

5428 bp

Amp

哺乳动物细胞表达

pcDNA 3.1/ mys-HisA

5494 bp

Amp

哺乳动物细胞表达

pCl-neo

5472 bp

Amp

哺乳动物细胞表达

pCMV-MCS

4.5 kbp

Amp

哺乳动物细胞表达

pET-3a

4640 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-11a

5677 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-15b(+)

5708 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-20b(+)

3716 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-22b(+)

5493 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-23a(+)

3666 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-23b(+)

3665 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-23c(+)

3664 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-23d(+)

3663 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-28a(+)

5369 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-28b(+)

5368 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-28c(+)

5367 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-30a(+)

5422 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-30b(+)

5421 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-30c(+)

5423 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-31b(+)

5742 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-32a(+)

5900 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-32b(+)

5899 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-32c(+)

5901 bp

Amp

大肠杆菌表达

pET-39b

6106 bp

Kan

大肠杆菌表达

pET-42a

5930 bp

Kan

大肠杆菌表达

pGAPZ-aA

3147 bp

Zeo

酵母表达

pGBKT7

7.3 kbp

Kan

酵母表达

pGEM3Zb



原核表达

pGEM3Zf(+)



原核表达

pGEM7Zf(+)



原核表达

pGEX-2T

4969 bp

Amp

原核表达

pGEX-4T-1

4969 bp

Amp

原核表达

pGFP-N2

4732 bp

Kan

哺乳动物细胞 荧光蛋白表达

pEGFP-C1

4731 bp

Kan

哺乳动物细胞 荧光蛋白表达

pEGFP-C3

4727 bp

Kan

哺乳动物细胞 荧光蛋白表达

pEGFP-N1

4733 bp

Kan

哺乳动物细胞 荧光蛋白表达

pLEGFP-N1

6892 bp

Amp

哺乳动物细胞 荧光蛋白表达

pGL3-Basic

4818 bp

Amp


pGL36




pLNCX

6620 bp

Amp

反转录病毒表达

pLNHX

5.6 kbp

Amp

反转录病毒表达

pLXSN

5.9 kbp

Amp

反转录病毒表达

pLXIN

6.1 kbp

Amp

反转录病毒表达

pMAL-p2x

6721 bp

Amp

原核融合蛋白表达

pMAL-c2x

6721 bp

Amp

原核融合蛋白表达

pPIC3.5K

9004 bp

Amp/Kan

酵母表达

pPIC9

8024 bp

Amp

酵母表达

pPIC9K

9276 bp

Amp

酵母表达

pPICZ aA

3593 bp

Zeo

酵母表达

pQBI PGK

5387 bp

Amp

哺乳动物细胞 荧光蛋白表达

pQE-30

3461 bp

Amp

原核表达

pQE-9

3439 bp

Amp

原核表达

pRevTRE

6487 bp

Amp

反转录病毒表达

pSE420L

4617 bp

Amp


pTac I


Amp

原核表达

pTac I(BamH I)


Amp

原核表达

pTAL-Luc

4956 bp

Amp

哺乳动物细胞表达

pTWIN1

7375 bp

Amp


pTXB1

6706 bp

Amp


pVAX1

2999 bp

Kan


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