滤纸条(万事开头难以后更难：先学SDS-PAGE再谈蛋白表达)

Posted 2023-06-01

篇首语：黄沙百战穿金甲，不破楼兰终不还。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了滤纸条(万事开头难以后更难：先学SDS-PAGE再谈蛋白表达)相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

滤纸条(万事开头难以后更难：先学SDS-PAGE再谈蛋白表达)

就像他们说的，

数学是火，点亮物理的灯；

物理是灯，照亮化学的路；

化学是路，通向生物的坑；

生物是坑，埋葬了理科生。

从678走来的我们，

都希望自己的人生从此"666",

然而现实却有一万种理由让你“555“。

虽然经常被人调侃

“生物专业不是文科吗？”

当年填报志愿时，

表哥那一句

"21世纪是生命科学的世纪"

仍回荡在耳旁，

”激励“着我前行。

作为专注蛋白表达的AtaGenix小编，

肯定要先扒一扒

那些SDS-PAGE的陈年往事。

毕竟，

敬业才是当前最重要的。

↓

先从PAGE说起。

PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis），聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化。催化聚合的常用方法有化学聚合法和光聚合法，化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE有Native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）和 SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶）两种形式。Native-PAGE过程中蛋白质能保持完整状态，并依据分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

而SDS-PAGE

仅根据蛋白质亚基分子量的不同

就可以分开蛋白质。

原因

↓

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

当年的高考状元（如今的实验狗）对原理有更详细的阐述：

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比有较高的分辨率。先把较稀的样品加在浓缩胶（作用是堆积，凝胶浓度较小，孔径较大）上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸时，电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。

电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

SDS-PAGE的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺-丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺-丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。用5-15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表（双丙烯酰胺-丙烯酰胺摩尔比为1：29）：

SDS-PAGE经常应用于蛋白提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

但在做SDS-PAGE实验过程中

有可能问题层出不穷

↓

SDS-PAGE二十二问给你答案

1、SDS-PAGE中各主要成分的作用是什么？

聚丙烯酰胺

丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

制胶缓冲液

浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris-HCl系统。

TEMED与AP

AP 催化单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成聚丙烯酰胺。TEMED是催凝剂，可加速AP催化作用。

SDS

阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物， SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。

甘氨酸

它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

上样缓冲液

蛋白上样缓冲液(loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散到电泳缓冲液。

2、样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：

1
还原SDS处理

在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中只根据分子量来分离。

注：一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5 min，再离心加样。

2
带有烷基化作用的还原SDS处理

碘乙酸胺的烷基化作用可以很好并经久牢固地保护SH基团，得到较窄的谱带。另外碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。

3
非还原SDS处理

生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1% SDS沸水中煮3 min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

3、两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?

玻璃没有洗干净。
过硫酸铵和TEMED的用量不合适，用量相对较多，凝胶凝固过快胶就会不平。
加完试剂以后没有很好地摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。
灌胶后没有立刻用水或者异丙醇压胶面：边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加异丙醇覆盖。浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶。另外还可以在压顶试剂如异丙醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。
温度也是影响胶聚合的重要因素，如果为了让胶更快地凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。

4、怎样防止胶漏？

每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其他附件。
避免玻璃边缘破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。
找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐。
胶条一定要干，跑完电泳后，胶条可放在实验台上晾着。
下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话可用保鲜膜垫在上面，或者反过来用。
玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封。装好架子后，可在玻璃底边抹上一层薄薄的凡士林（两边多点，容易从两边漏）。转移到电泳槽的时候去掉封条，把底上的凡士林擦干（注意一定要擦干净，尤其是少量进入了两块玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果）。
可以在海绵垫下再垫一些纸，使它与玻璃贴的更紧密，或者在玻璃底部用琼脂糖封上。
先把两块玻片放在夹子上，使底部对齐，再夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片。

5、分离胶加上后为什么要立即加水？

一是为了使分离胶界面保持水平（用水就可以把它压平），使蛋白质分子跑时在同一水平线上。
二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

6、怎么处理“ 微笑”（两边翘起中间凹下）条带的形成？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致（多出现于较厚的凝胶中），可待其充分凝固再做后续实验。

7、怎么处理“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,当凝胶和玻璃板组成的"三明治"底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

8、出现拖尾现象应该怎么办？

主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。可在加样前离心、选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂、重新配制时间过长的电泳缓冲液或者降低凝胶浓度。

9、出现纹理（纵向条带）现象应该怎么办？

主要是不溶性样品颗粒引起的，可在加样前离心或加适量样品促溶剂。

10、蛋白带偏斜怎么办？

常常是由于滤纸条或电极放置不平行或加样位置偏斜而引起，检查位置是否正确并作出相应调整。

11、蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连？

这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的，可减少加样量。

12、蛋白带模糊不清和分辨不佳？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

为了提高分辨率,不要加过多的样品,小体积样品可跑出窄带。
加样后应立即电泳,以防止扩散。
选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离。
样品的蛋白水解作用（系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白）也引起扩散而使分辨率降低，在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可减少这种情况的发生。

13、什么是“鬼带”，如何处理？

在跑构象复杂的蛋白质分子时，“鬼带”常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。主要是还原剂在加热过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。可在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta-巯基乙醇，以补充不足的还原剂或加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

14、为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象,这主要与缓冲液和分离胶的浓度有关，可更换正确pH值的缓冲液或降低分离胶的浓度。

15、为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是蛋白未浓缩好的原因。可适当增加浓缩胶的长度，保证浓缩胶贮液的pH正确（pH6.7）或适当降低电压。

16、为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者容易遇到。比如电压50 v以上，可电流却在5 mA以下。这主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路所致。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。将电泳槽正确装配即可。

17、浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致，后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧导致空气进入引起的。

18、蛋白带型聚团是什么引起的？

上样过量：降低蛋白上样量或降低蛋白浓度。
样品粘度过大：延长煮沸时间。
样品中含有不溶物质：离心或过滤样品以除去特定污染物。
制胶不佳：确保制胶均匀，一次完成。

19、凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30 min-1 h内凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED和APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用。TEMED不稳定，易被氧化成黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

20、电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误，即缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

21、蛋白Marker条带缺失或条带模糊怎么办？

分离胶浓度不正确：配置浓度正确的分离胶。
缓冲液放置时间过长：定期更换缓冲液。
甲叉丙烯酰胺贮存液放置时间过长或配置不准确：及时更新贮存液，此贮存液配制时在37℃水浴溶解30 min以上。
电泳时间过长：观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间。

22、条带跑得比正常的窄？

可能因为胶凝得不均匀，聚合得不是很好：灌胶的时候尽量混匀。
可能与拔梳子有关：拔梳应该迅速。
冲洗加样孔时要小心，以免把上样带扭曲。
胶配好了用枪吹几下再灌胶。
等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。
可能是样品的问题：如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一。
常见的原因是每孔上样量不均匀：应确保每孔中上样量一致。
有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液：更新缓冲液。