溶菌酶测定实验报告(多糖寡糖蛋白酶在促生长、助消化提升免疫力方面重要性您知道吗？)

Posted 2023-06-01

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溶菌酶测定实验报告(多糖寡糖蛋白酶在促生长、助消化提升免疫力方面重要性您知道吗？)

谭崇桂1，冷向军*1,2，李小勤1,2，粟雄高1，刘波1，柴仙琦1（1上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306，中国）（2农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海，201306，中国）

摘要：为考察饲料中添加β-葡聚糖、黄芪多糖、甘露寡糖和蛋白酶对凡纳滨对虾生长性能、血清非特异性免疫及消化酶活性的影响，在基础饲料(对照组)中添加0.2%β-葡聚糖、0.05%黄芪多糖、0.4%甘露寡糖、175mg/kg蛋白酶PT，选取初始体重为4.55±0.08g的凡纳滨对虾（Litopnnaus vannamei）1000尾，分为5处理组，每处理组4重复，每重复50尾虾，分别饲喂上述5组饲料6周。

结果表明：与对照组相比，饲料中添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖及175mg/kg蛋白酶PT可分别提高凡纳滨对虾增重率16.19%、12.78%、11.25%（P<0.05），提高蛋白质效率8.67%、8.32%、8.04%（P<0.05），降低饲料系数0.10、0.09、0.09（P<0.05)。

各处理组在肌肉水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白含量上无显著差异(P>0.05)。

在血清非特异性免疫方面，各多糖、寡糖和蛋白酶添加组均显著提高血清酚氧化酶活力（P<0.05），但在丙二醛含量方面无显著差异(P>0.05)；

添加0.4%甘露寡糖可提高溶菌酶、碱性磷酸酶活力（P<0.05）；添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖可显著提高超氧化物歧化酶活力（P<0.05）。

在消化酶活性方面，添加0.05%黄芪多糖及175mg/kg蛋白酶PT可显著提高肝胰脏蛋白酶活性（P<0.05），添加175mg/kg蛋白酶PT显著提高肠蛋白酶活性（P<0.05），添加0.2%β-葡聚糖及0.4%甘露寡糖显著提高胃蛋白酶活性（P<0.05），添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖及175mg/kg蛋白酶PT显著提高肝胰脏脂肪酶活性（P<0.05）。

上述结果表明，饲料中添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖可提高凡纳滨对虾生长性能、血清非特异性免疫，改善消化酶活性；添加175mg/kg蛋白酶PT可提高凡纳滨对虾增重率，改善消化酶活性；添加0.05%黄芪多糖对凡纳滨对虾增重率、血清非特异免疫无显著影响。

近年来水产养殖业快速发展的同时，也出现了环境污染，水产动物抗病力下降和病害加剧等问题；

同时由于鱼粉价格上涨，植物蛋白的大量使用，导致饲料消化利用率降低。寻求绿色、环保、高效的添加剂已成为水产动物营养与饲料学研究的热点。

在这方面，免疫多糖、功能性寡糖和酶制剂因具有调节肠道微生物菌群，提高机体免疫功能，提高营养物质消化率的作用而受到重视。

β-葡聚糖作为免疫增强剂在水产动物上已有较多报道[1-2]。

在虾类方面，饲料中添加0.2%β-葡聚糖可显著提高凡纳滨对虾增重率[3]，提高溶菌酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性[4]；

添加10g/kg的β-1，3-葡聚糖，可以提高斑节对虾(Penaeus monodon)感染白斑综合症病毒后的存活率[5]；

黄芪多糖[6-7]、甘露寡糖[8-10] 、蛋白酶[11-16]在鱼类的研究中也有一些报道，但在虾类中均研究报道较少。

本试验以凡纳滨对虾为研究对象，在饲料中分别添加0.2%β-葡聚糖、0.05%黄芪多糖、0.4%甘露寡糖、175mg/kg蛋白酶PT，考察并比较几种添加剂对凡纳滨对虾生长性能、肌肉成分、消化酶活性、血清非特异性免疫指标影响，为多糖、寡糖、蛋白酶在对虾饲料中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲料

在基础饲料中分别添加0.0%（对照组）、0.2%β-葡聚糖（由广州信豚生物科技有限公司提供，β-葡聚糖有效含量25%）、0.4%甘露寡糖（由北京奥特奇生物科技有限公司提供，甘露寡糖含量为12%）、 175mg/kg蛋白酶PT（由加拿大JEFO公司提供，为一种耐高温的碱性蛋白酶）、0.05%黄芪多糖（上海朝翔生物技术有限公司提供，主要成分为35%黄芪多糖及11%黄芪甲甙），共5个处理组。

基础饲料组成及营养成分见表1。饲料原料均过60目筛，采用逐级混匀的方法将原料混合，用绞肉机制成直径为1mm的硬颗粒沉性饲料，95℃后熟化25min，自然风干，4℃保存备用。

1.2 试验用虾及饲养管理

试验用虾购于上海市青浦区水产养殖场。对虾运回后，暂养在网箱(2.5m×1.2m×1.0m)中，网箱置于水泥池（5.0m×3.0m×1.2m）中，用基础饲料驯化一周，以适应饲料与环境。

选用均重为4.55g左右、规格均匀、体质健壮的1000尾虾开始正式试验。试验虾共分为5组，每组四重复，每个网箱为一个重复，每重复50尾虾。

每天投喂三次（5:30、12:30、18:30），日投饵量约占虾体重的3%~5%，早晚投喂量约占总投喂量的70%，并根据实际情况做适当调整。

每隔3d吸污与换水，保持水质。养殖期间水温25~30℃，DO>5mg.L-1，PH:7~8，NH4+-N<0.2mg/L，养殖时间为2011年8月6日至2011年9月16日，共6周，合计42d。养殖试验在上海海洋大学南汇特种水产养殖场进行。

1.3 生长性能

养殖试验结束后，试验虾饥饿24h，称重，计算增重率(RWG）、蛋白质效率(PER)、成活率（RS）、饲料系数（FCR）。

RWG=100×(W1－W0)/W0

PER=(W1－W0)/WP

RS=100×NS/NT

FCR=FT/(W1－W0)

式中：W0为平均初始体重（g）；W1为平均终末体重（g）；WP为蛋白质摄取量（g）；FT为总投饲量（g）；NS为成活尾数；NT为总尾数。

1.4 肌肉常规成分

养殖结束后，每重复采虾5尾，取肌肉样品-20℃冷冻保存用于常规成分分析，样品分析采用国际标准方法[18]。

水分测定采用105℃烘干恒重法，粗蛋白测定采用凯氏定氮法，粗脂肪测定采用氯仿-甲醇法，粗灰分测定采用550℃灼烧法。

1.5 血清非特异性免疫指标

养殖试验结束后，试验虾饥饿24h，每池随机取虾15尾，自虾的头胸甲后插入围心腔取血淋巴液，置于离心管中，4℃，5000r/min,离心10min,取上清液用作血清非特异性免疫指标的测定。

其中溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、丙二醛均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

溶菌酶：采用比浊法，溶菌酶含量（U/mL）=（测定管透光度UT2-测定管透光度UT1）/（标准管透光度ST2-标准管透光度ST1）×标准管浓度（200U/mL）×样本测试前稀释倍数；

超氧化物歧化酶（SOD）：采用黄嘌呤氧化酶法，1个SOD活力单位（U）定义为每mL血清中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量；

碱性磷酸酶（AKP）：1个单位（U）定义为每mL血清在37℃与基质作用15分钟产生1mg酚；

丙二醛（MDA）：采用硫代巴比妥酸（TBA）法；酚氧化酶：以左旋多巴为底物，参照Ashida[19]的方法进行操作。

将3mL的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=6.4）、100μL血清及100μL左旋多巴在室温下混匀，490nm波长下，每2min读取光度密值。

以OD490对反应时间作图，以实验条件下每分钟光密度值增加0.001为1个活性单位（U）。

1.6消化酶

在解剖盘的冰浴中解剖虾，取胃、肠道、肝胰脏等组织，-20℃保存。测定时4℃解冻，，加入10倍体积的预冷重蒸水，4℃匀浆，离心10min（5000r/min），取上清液，即为粗酶液。

蛋白酶参照DIVAKARAN[20]方法进行测定。胃、肠、肝胰脏蛋白酶的活性为1mg鲜组织在pH分别为3.0、7.2、9.8时每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活性单位（U）；

脂肪酶、淀粉酶测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，脂肪酶单位定义为：在37℃条件下，每g组织蛋白在本反应体系中与底物反应1min，每消耗1μmol底物为一个酶活力单位（U/g）；

淀粉酶的测定采用碘-淀粉比色法，每g组织蛋白在37℃与底物作用30min，水解10mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位(U/g)。

1.7 数据统计

试验结果数据以平均值±标准差表示，采用SPSS16.0进行差异显著性分析和多重比较（Ducan氏法），差异显著水平为P<0.05。

2 结果

2.1对生长性能及饲料利用的影响

多糖、寡糖、蛋白酶对凡纳滨对虾生长性能及饲料利用的影响见表2。

与对照组相比，饲料中添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖、175mg/kg蛋白酶PT分别提高凡纳滨对虾增重率16.19%、12.78%、11.25%（P<0.05），提高蛋白质效率8.67%、8.32%、8.04%，降低饲料系数0.10、0.09、0.09(P<0.05)；黄芪多糖也有提高增重率及蛋白质效率，降低饲料系数的趋势，但与对照组差异不显著(P>0.05)。

2.2对肌肉成分的影响

多糖、寡糖、蛋白酶对凡纳滨对虾肌肉成分的影响见表3。各组间水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分无显著差异(P>0.05)。

2.3对血清免疫指标的影响

多糖、寡糖、蛋白酶对凡纳滨对虾血清免疫指标的影响见表4。

与对照组相比，饲料中添加0.4%甘露寡糖可显著提高溶菌酶及碱性磷酸酶活性（P<0.05）；

添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖可显著提高超氧化物歧化酶活性（P<0.05）；各添加剂组均显著提高酚氧化酶活性（P<0.05），但在丙二醛含量方面无显著差异（P>0.05）。

2.4 对消化酶活性的影响

由表5可知，饲料中添加0.05%黄芪多糖、175mg/kg蛋白酶PT可显著提高凡纳滨对虾肝胰脏蛋白酶活性（P<0.05）；添加175mg/kg蛋白酶PT可显著提高肠蛋白酶活性（P<0.05）；

添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖可显著提高胃蛋白酶活性（P<0.05）；添加0.2%β-葡聚糖、0.4%甘露寡糖、175mg/kg蛋白酶PT显著提高肝胰脏脂肪酶活性（P<0.05）；各组在肝胰脏淀粉酶活性方面无显著差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 β-葡聚糖对凡纳滨对虾生长和血清非特异性免疫的影响

β-葡聚糖作为免疫增强剂在捉进水产动物生长、增强免疫力方面已有较多研究报道[1，21]。

在对虾的研究中表明，在饲料中分别添加0.2%[3]及0.4%β-葡聚糖[22]，均可显著提高凡纳滨对虾增重率。

本试验也获得相似效果，饲料中添加0.2%β-葡聚糖可提高凡纳滨对虾增重率16.19%，降低饲料系数0.10（P<0.05）。

有关β-葡聚糖促生长作用机制尚不清楚，推测β-葡聚糖可被消化提供能量，从而起到节约蛋白的作用[23]。

对虾免疫系统中存在着识别β-葡聚糖的结合蛋白，当两者相结合时，结合物可与颗粒细胞膜的受体相结合，从而激活免疫系统[24]。

研究表明，间断性投喂β-葡聚糖可以使凡纳滨对虾的免疫力维持在一个较高的水平，消除免疫疲劳[25]；

在饲料中添加2g/kg酵母细胞壁及2g/kg β-葡聚糖可提高凡纳滨对虾溶菌酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性，提高机体抗病能力[4]；

添加0.09%β-1，3-葡聚糖，可显著提高大黄鱼血清溶菌酶活力，头肾白细胞的吞噬活性，显著提高大黄鱼被哈维氏菌感染后的成活率（P<0.05）[1]；

用0.5mg/ml、1mg/ml β-葡聚糖悬浮夜浸泡斑节对虾幼虾，可提高酚氧化酶活力及抗菌活力[26]。

Chang等[5]研究表明：摄食10g/kg的β-1，3-葡聚糖后，可以提高斑节对虾感染白斑综合症病毒后的存活率。

本试验在饲料中添加0.2%β-葡聚糖可显著提高凡纳滨对虾血清超氧化歧化酶及酚氧化酶活力。

3.2 黄芪多糖对凡纳滨对虾的作用效果

黄芪多糖是黄芪的根系经浓缩后的干燥粉末，具有免疫促进剂的功能。研究表明，饲料中添加0.04%黄芪多糖，显著提高了齐口裂腹鱼增重率和饲料效率[6]；

添加0.5%黄芪多糖，提高刺参增重率20.94%，同时也提高蛋白酶活性[27]。黄芪多糖不仅具有促生长作用，而且还影响机体的免疫机能。

在凡纳滨对虾腹部体腔注射0.1ml/尾的“鱼虾宝”（主要成分为人参皂苷和黄芪多糖）72h后，酸性磷酸酶及碱性磷酸酶活性明显上升[7]。

许杜娟[28]研究表明，黄芪多糖对脾细胞干扰素-γ和腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子-α的产生有显著促进作用。

本试验在饲料中添加0.05%黄芪多糖，对凡纳滨对虾增重率、消化酶及非特异性免疫因子均无显著影响，这可能与黄芪多糖的添加量不足有关。

今后应当设置黄芪多糖不同的添加量梯度，以寻求最佳添加量。

3.3 甘露寡糖对凡纳滨对虾生长、消化酶活性及血清非特异性免疫的影响

甘露寡糖是从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质，是由甘露糖和葡萄糖组成的寡糖。

研究表明：饲料中添加0.2%、0.4%甘露寡糖能显著提高舌齿鲈增重率15.6%、14.5% [29]；

添加0.5%、0.75%甘露寡糖提高奥尼罗非鱼增重率13.7%、13.1%，降低饲料系数0.21、0.20[10]。

在虹鳟[8]、鲤[9]、黄颡鱼[30]饲料中添加0.2%甘露寡糖均可显著提高鱼体增重率、降低饲料系数。

本试验中，饲料中添加0.4%甘露寡糖可提高凡纳滨对虾增重率12.78%（P<0.05），降低饲料系数0.09（P<0.05）；

甘露寡糖对凡纳滨对虾的促生长作用，可能与改善肠道微生物菌群，促进肠道有益菌的生长，改善肠道内环境，从提高营养物质消化率有关[31-32]。

消化酶活性的增强可提高营养物质的消化率。目前，有关甘露寡糖对动物消化酶活性影响的报道较少。

在罗非鱼饲料中添加0.75%甘露寡糖，可提高干物质消化率、粗蛋白消化率14.3%、4.9%[10]。

本试验在饲料中添加0.4%甘露寡糖显著提高胃蛋白酶及肝胰脏脂肪酶活性。甘露寡糖对消化酶活性的作用，可能与甘露寡糖有益于肠黏膜上皮细胞的排列，并能改善肠绒毛高度、厚度有关[33]。

今后应当制作凡纳滨对虾消化道的组织切片，并对营养物质消化率进行测定，以寻求更直接的证据。

甘露寡糖不仅改善动物生长性能，还影响机体的免疫系统。饲料中添加0.75%甘露寡糖，可显著提高奥尼罗非鱼血清超氧化物歧化酶及碱性磷酸酶活性[10]；

添加0.2%甘露寡糖显著提高虹鳟[8]、鲤鱼[9]血清溶菌酶活性；本试验在凡纳滨对虾饲料中添加0.4%甘露寡糖，可不同程度提高血清溶菌酶、酚氧化酶、超氧化物歧化酶及碱性磷酸酶活性，而这些酶是虾体重要的非特异性免疫因子。

甘露寡糖提高动物非特异性免疫功能，可能与甘露寡糖可以促进有益菌的生长、抑制有害菌的繁殖有关[31]，其作用机理有待进一步研究。

3.4 蛋白酶PT对凡纳滨对虾生长和消化酶活性的影响

蛋白酶PT是一种耐高温的碱性蛋白酶，本实验室已就蛋白酶PT在水产饲料中的应用开展了较多的研究；

结果表明：在鱼粉含量为10%及6%的鲤鱼饲料中添加175mg/kg蛋白酶PT，均显著提高鲤鱼的增重率，降低饲料系数[16]；在鱼粉含量为26.4%的凡纳滨对虾幼虾饲料中添加175mg/kg蛋白酶PT，可提高增重率10.8%(P=0.096) [15]。

本次试验进一步将饲料鱼粉含量降为23.0%，添加175mg/kg蛋白酶PT，结果显示提高凡纳滨对虾增重率11.25%（P<0.05），降低饲料系数0.09（P<0.05），与上述报一致。

同时本试验添加蛋白PT后，可提高肝胰脏蛋白酶、肠蛋白酶及肝胰脏脂肪酶的活性（P<0.05）。

蛋白酶PT在低鱼粉含量时改善水产动物生长性能可能是由于在低鱼粉条件下，植物蛋白含量高，可消化蛋白质降低，氨基酸组成不平衡，添加外源酶后，促进植物蛋白降解，提高蛋白质的利用率，因而提高动物生长性能及饲料利用率[16]

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