温湿度棒(大小鼠转棒疲劳仪的使用方法与实验方法)

Posted 2023-06-01

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温湿度棒(大小鼠转棒疲劳仪的使用方法与实验方法)

仪器介绍

转棒仪本质上是一种简单的设备，设计来转动水平旋转杆。该测试的商业化导致了一种更复杂的设备的逐步演变。该设备以电子方式运行，并且可以很容易地编程，以提供更为定制的数据收集方法，甚至可以提供安全、质量可靠、符合GLP的数据记录，以满足药物开发中的法规遵从性。使用该设备的较新版本，旋转杆可以在预先编程的时间段内以任意数量的不同速度运行，从而可以在同一试验中完成分步测试。同样地，该装置可以被编程为在不同的时间长度内以不同的加速度加速，并且甚至可以在需要时反向运行横杆。因此，有许多选项来修改测试方案，以适应实验的具体要求。然而，就大多数实验目的而言，定速和加速版本被广泛使用，可以认为是广泛的实验模型领域的标准，可以满足大多数实验室的需求。

【原文地址：鼠类行为学丨大小鼠转棒疲劳仪实验方法 - 知鼠达理的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/605366964】

仪器主要包括一个旋转杆，驱动电机和齿轮传动系统。旋转杆的长度和直径取决于要测试的啮齿动物种类。以小鼠为例，转棒仪器的尺寸：旋转杆直径约为3 cm，商业设备中的杆通常由有机玻璃或其他硬质塑料制成，旋转杆表面沿纵轴形成一系列平行的水平凹槽，使小鼠能够有效地抓住它。凹槽的深度是一个至关重要的细节，如果小鼠不能实现良好的抓握力，测试将会非常困难；另一方面，如果抓握力太好了，小鼠会被动地抓住杆跟随其旋转。旋转杆通常支撑在仪器底座上方30 ～50 cm，如果设置的高度太低，容易导致动物不进行任务，而倾向于从杆上跳下来。在仪器的底部放置一个柔软的软垫，给跌落下来的小鼠作为缓冲。正常情况下，这种仪器坠落并不会对动物造成任何伤害。可以根据需要设计测试容量，商业设备通常包括多个通道（一般设置6个通道），可以并行测试相应数量的动物。有些商业设备设计为每个通道可以独立开始实验。通道由塑料隔板或者法兰（圆形的部件）隔开，法兰的直径为20～30 cm。通道的宽度约为6 cm，但如果未成年小鼠倾向于在杆上转身，可能需要调整得更小。一般商业设备的转速范围为0-100 rpm/min（一般实验设计速度范围为4～40 rpm），精度为0.1 rpm/min。实验时间可分段，每段可以设置不同的时间、速度、加速度，可灵活设置匀加速、匀减速实验。

设备包括定时装置，它在电机打开时会自动启动，每个通道下铺设有红外旋转杆，旋转杆中断时，代表动物跌落，计时停止，用于测量从旋转杆上跌落的潜伏期。潜伏期数据传输到计算机上，并记录动物落棒的原因（例如跌落、跳跃）。仪器也可以自动统计每组的均值、标准差，方便查看结果。大鼠的关键设备参数可设置为：旋转杆直径7～8 cm，距离地面50 cm，通道宽10cm。

图1：大鼠转棒仪装置的正视图和侧视图。所有尺寸均为厘米。

实验动物的选择

转棒疲劳仪适用于啮齿类动物，更通常用于评估小鼠的运动能力。越来越多的研究人员正在使用转基因（Tg）小鼠疾病模型作为探测疾病过程的生化，细胞和行为方面的工具，并筛选新的治疗方法。因此，对Tg模型的背景品系的选择对于对这些动物的疾病状态进行准确的多因素评估至关重要。为了确定运动测试中表现的品系差异，以评估它们在预期运动参数发生变化的疾病中作为基因修饰小鼠的背景品系的适用性，并确定小鼠表现是否随时间以品系特异性方式变化（这可能成为长期重复测试研究的混杂变量），有研究使用了六种近交小鼠品系进行测试，使用的品系包括129S2 / SvHsd，BALB / cOlaHsd，C3H / HeHNsd，C57BL / 6J，CBA / CaOlaHsd，DBA / 2OlaHsd。结果表明，在旨在量化小鼠运动协调性的行为任务中存在相当大的品系差异，而且，品系特定的表现变化可以随着重复测试而变化。DBA/2在定速旋转任务上的表现明显差于使用的其他小鼠品系的表现，并且有点令人惊讶的是，表现的损害发生在相对较低的速度（7～23 rpm）下，而不是在更高的速度下。

有趣的是，CBA/Ca的表现随时间变化最明显，在第8周表现似乎比其他几周更具弹性。定速旋转任务比更常用的加速旋转任务对小鼠的运动变化更敏感，后者未能确定品系或重复试验的显着主要影响。另外，与以往研究一致，C57BL / 6J和CBA / Ca小鼠品系在加速旋转任务上表现良好，而DBA小鼠表现不佳，这表明加速旋转是评估运动协调的可靠方法。特别令人感兴趣的是发现，随着重复测试，表现存在品系特定的变化。使用的6种小鼠品系中有5种的表现随着时间的推移保持稳定。然而，DBA / 2小鼠了解到从杆上掉下来会产生有益的后果（返回饲养笼），因此没有动力留在设备上。这种行为适应导致了这种特定小鼠品系的较大误差，并导致整体的显着影响。我们建议，如果要将Tg小鼠用于行为测试，则必须非常小心地选择维持Tg小鼠系的潜在背景品系。129S2/Sv品系和DBA/2品系作为纯品系不适合进行行为测试，这是因为前者品系的冷漠性质和后者的性能可变性。

也有研究者研究了一些近交系，以确定转棒测试的任务表现和运动学习是否存在遗传变异。在改进的加速版本的转棒模型中，小鼠每天接受三次试验，持续三天，并记录每天的转棒表现。测试了雄性和雌性129S1/SvlmJ、A/J、BALB/cByJ、C3H/HeJ、C57BL/6J、CBA/J、DBA/2J和FVB/NJ小鼠。在运动表现方面观察到了品系和性别差异。一些品系通常表现更好（如C57BL/6J和CBA/J），而其他品系表现较差（如A/J）。129S1/SvImJ与其他亚系相比为中等表现，其中129S6/SvEvTac表现最好，129P1/ReJ表现最差。不同品系的运动学习能力也有所不同，因为一些品系在三天内表现出任务表现提高，而其他品系则没有，如DBA/2J、A/J在连续训练中没有表现出运动技能的学习能力。

这些研究综合表明，背景品系的选择是转基因小鼠疾病模型中运动缺陷重复行为评估的关键考虑因素。

实验程序

转棒测试通过评估动物保持在旋转杆上的能力，比较对照组与疾病模型/干预组啮齿动物的运动表现。转棒任务可以使用多个版本的方案，主要是转速、加速度和测试时间等参数有所不同。

1.实验材料：

1)适当的小鼠品系和饲养环境。

2)70%乙醇喷雾和吸水性纸巾用于清洁仪器。

3)转棒疲劳仪。

2.设备运行准备：

1)设置旋转杆的速度，在现代商业仪器上，这是一个可编程的参数。

2)检测红外光束是否灵敏度正常。

3.训练动物：

动物应适应实验设备，以尽量减少可能导致它们无意中从杆上掉下来的焦虑和探索行为。

1)对于运动协调能力的测试，不需要采集训练时的数据。

2)先设置一个较慢的转棒速度，通常为4 rpm，将小鼠放置在旋转杆上，这样运行1 min。对于正常小鼠，将杆的速度提高到10 rpm，运行2 min，当在这个速度下成功时，进一步增加速度到30 rpm，并让小鼠再保持3 min。在这一阶段完成后，根据使用的小鼠品系，应该给予小鼠15分钟的休息或允许继续训练。附带条件是，如果训练过程中它们从杆上掉下来，应该将其放回到它们的饲养笼里进行15分钟的恢复。

3)完成上述训练后，允许小鼠继续训练标准的转棒测试的试验。将它们放置在仪器上，并允许它们按照测试程序进行试验（见下文），直到它们达到稳定的表现水平。

4)对于加速版本转棒实验，小鼠放置在旋转杆上，杆加速到预设的终点，通常初始速度为 4 rpm，加速度为 20 rpm/min，直到达到最大速度40 rpm。对于固定速度的方案，应该训练小鼠在每个速度下达到最佳表现。

5)在训练结束后，至少等待24小时再进行正式试验。

4. 用转棒仪测量动物的运动协调/平衡

对于所有试验，在试验前30 min将小鼠带到实验室，以确保它们完全清醒。一般来说，为了让肌肉力量和觉醒水平恢复到正常，在每次运动测试后都放回到笼子里，让小鼠休息。

4.1 加速旋转版本测试

1)捏住小鼠尾巴后1/3处，将小鼠放在静止的旋转杆上，背向杆旋转的方向，每个通道里都放一只小鼠。

2)启动转棒，并同时开始自动计时。一般加速度设置为20 rpm/min。

3)当小鼠从旋转杆上掉下来时，如果可能的话，及时将它从设备里取出，然后放回笼子里。

4)在5 min结束时，将所有仍然保持在杆上的小鼠移到饲养笼里。

5)记录小鼠从旋转杆上跌落下来的潜伏期（小鼠停留在旋转杆上的时间），如果它们成功完成了整个测试周期，则记录最大分数300秒。

6)通常，理想的方法是进行多次试验，重复试验两到三次，每次至少间隔15 min。

7)计算出这些试验得分的平均值。这是一种典型的方法，但如果对每个单独试验的表现都很感兴趣，也可以使用原始形式的数据。

8)采用非配对t检验分析两组动物在单个试验数据或平均试验的单个数据集的差异。

9)如果对一系列试验的表现感兴趣，则需要进行多因素方差分析（ANOVA），包括一个受试者内因素（试验次数、药物剂量或重复测量设计中的其他测试条件）和任何受试者间因素（例如，脑区损毁、基因型或小鼠之间不同的治疗）。对于纵向研究，将增加一个额外的受试者内因素（时间点或年龄）。

4.2 定速旋转版本测试

1)将旋转杆的速度设置在所需的最低速度。

2)将小鼠放在旋转杆上，每个通道里都放上一只小鼠。

3)启动转棒，并同时开始自动计时，测试时间最长1min。

4)当小鼠从旋转杆上掉下来时，如果可能的话，及时将它从设备里取出，然后放回笼子里。

5)当所有小鼠完成1 min的试验后，移出它们，然后放回到饲养笼里。

6)记录下小鼠能够保持在旋转杆上的潜伏期时间。

7)每个试验之间至少间隔5 min。

8)将设备重置到下一个要使用的速度。

9)重复步骤2）至8），直到对所有所需的旋转杆速度进行完试验为止。

10)通常需要进行多次试验。在最小间隔15 min后，以新的上升速度系列重复测试。

11)计算这些试验得分的平均值。这是一种典型的方法，但如果每个试验的表现都感兴趣，请使用原始形式的数据。

12)如果只使用单个速度来确定两组小鼠之间的差异，则应用非配对t检验。对于多个速度，应用至少一个受试者内部因素（杆速度）和通常至少一个受试者间因素（例如，基因型或损毁组）的方差分析。

13)药物或其他治疗将在分析中提供第三个处理因素，受试者内因素或受试者间因素取决于采用的是重复测量还是随机设计。对于纵向研究，还需要第二个受试者内变量（时间点）。

数据收集和评价指标

大多数方案要么测试动物在给定的时间内停留的最大速度，要么测试动物在不同速度下跌落所需的时间。商业转棒仪可以自动记录动物的跌落潜伏期（动物保持在杆上的时间）和跌落时的旋转速度，这是动物运动协调性的主要指标，尤其是前者。同时还能记录试验结束的原因，跌落、跳跃或被动旋转。一些研究也应用了额外的或替代的指标，例如运动的距离，在规定的持续时间内在旋转杆上保持平衡的动物数量，或在实验运行期间从旋转杆上跌落和动物抓住杆被动旋转的次数。另外，可以以日期为横坐标，潜伏期为纵坐标绘制初始实验期间的任务学习曲线，通常随着每日训练任务表现显著提高。

数据统计与分析

根据研究人员的经验，在转棒测试中，大约8只动物的样本量就能提供足够的能力来检测组平均值中10%到15%的差异。对于方差的统计同质性，小鼠的数量至少不应低于6只。

根据需要对数据进行方差分析，在适当的情况下，使用组间重复测量比较。对于事后分析，Tukey HSD测试用于确定组之间的成对差异，Dunnetts测试用于确定给定数据集与该数据集的控制值之间的显着差异。当存在显著的相互作用时，使用Sidak检验在组间进行一系列独立的事后两两比较。差异在P ＜0.05时被认为是显着的。数据以平均值±标准误表示。

注意事项

1.小鼠五到八只为一笼，饲养在温度，湿度和光受控的环境中。保持12小时光/暗循环，早上8点亮灯。饲养室和实验室的温度保持在20 ± 2°C, 相对湿度为60%。除非在实验过程中，平时小鼠可以随意获得食物和水。尽一切努力尽量减少动物的数量及其痛苦。

2.在行为测试之前，抚摩大鼠和小鼠是很重要的（所有组中的所有动物都以相同的方式抚摩到相同的程度）。这将使动物克服会对表现产生重大影响的自然恐惧和焦虑反应。

3.在测试开始之前，将动物送至行为测试室，让它们不受干扰地适应30分钟，然后称重并记录。测试可以在上午8点至下午4点之间进行，重要是是保持不同测试日的测试时间点一致。

4.不同小鼠品系获得稳定的基线表现水平所需的训练量有所不同，但长时间暴露于逐渐增加的旋转速度的一般原则是适用的。在训练过程中，如果该方案对所使用的特定小鼠品系来说太累，可能有必要允许小鼠休息，休息15分钟通常是足够的。

5.所需的试验次数可能因使用的小鼠品系而有所不同。在脑区损毁或遗传性疾病模型的小鼠中，建议进行一次以上的试验，因为单个实验动物的分数通常有更大的差异。类似地，在纵向研究中，如果小鼠有一段时间没有进行过测试了，第一次试验可以作为提醒，在这种情况下，可能需要3次或4次试验，可采用后2次或3次数据的数据分析。

6.实验时转棒速度的设计应考虑到疾病的严重程度。应该至少有一个较慢的速度，使大多数小鼠能够保持在旋转杆上。理想情况下，后续的速度应该产生一个代表疾病或其他处理因素（如给药测试）严重程度的数据曲线。无法进行任务的比例应低于10%。随着动物在疾病的后期变得更加虚弱，这种情况可能会增加。

7.最好在开始研究之前选择重新测试的频率。例如，如果正在研究一种测试化合物的短期影响，那么一次测试可能就足够了。然而，如果正在调查复合治疗、损毁或其他治疗的长期影响，或者如果确定慢性表型，最好在几周内每周进行重新测试，或连续几个月每月进行重新测试。因此，在开始主要研究之前，通常需要进行预实验来确定适当的实验设计、测试频率、发病年龄和表型持续时间。

8.一定要在每只被测试小鼠之间对设备进行清洁和消毒。小鼠经常在旋转杆上小便和排便。杆子上的尿液和粪便会损害其他测试小鼠的表现。因此，经常清洗仪器是很重要的。

9.实验室环境在测试期间应保持温度、湿度和光强度不变。