混旋醋酸棉酚(动物源性食品中细菌的检测——弯曲杆菌)

Posted 2023-06-01

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混旋醋酸棉酚(动物源性食品中细菌的检测——弯曲杆菌)

弯曲杆菌属是一组人畜共患病的病原微生物，其感染在世界范围内相当普遍。弯曲杆菌从1909年开始在兽医领域里被重视。该菌在牛肠道中最早被发现，以后又在猪、羊、犬、鸡及多种野生动物的腹泻粪便和正常粪便中检出，在我国的分布也十分广泛。该菌属有胎儿弯曲杆菌（Campylobacter fetus）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、唾液弯曲杆菌（Campylobacter sputorum）、结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）和简洁弯曲杆菌（Campylobacter concisus）5个正式种，另外还有5个位置不定的种，其中包括粪弯曲杆菌（Campylobacter fecalis）。空肠弯曲杆菌过去属于胎儿弯曲杆菌的一个亚种，结肠弯曲杆菌过去属于胎儿弯曲杆菌空肠亚种。

空肠弯曲杆菌是近年来受到各国学者广泛重视的一种人畜共患病的病原菌。1984年Simbert等将其列为弯曲杆菌的一个独立种，称为空肠弯曲杆菌。早在1957年King就首次发现该菌与人类肠炎的关系，但直到1977年Skirrow和1979年Butzler分别利用抑制肠道菌丛的培养基，从而大大提高了粪便中该菌的检出率后，世界各地关于空肠弯曲杆菌的报道才日益增多。自1980年起WHO已将空肠弯曲杆菌病列为常见的食源性疾病。但空肠弯曲杆菌并没有得到足够的重视，原因在于该菌所引起的疾病致死率较低，与温血动物有关，该菌与沙门氏菌、大肠杆菌不同，能够脱离畜主而存活下来，对环境条件极为敏感，较易控制。最近数十年，发达国家的空肠弯曲杆菌病的发病人数逐年增长，仅在美国每年的发病人数就高达250万人次。空肠弯曲杆菌因可引起格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）而日益受到世界各国科学家的关注。

1 病原学特征

弯曲杆菌属的细菌是一种纤细的、螺旋形、弯曲杆状的革兰氏染色阴性菌，也可出现S形、逗点状或似飞翔的海鸥形，不形成芽孢。一般大小为（0.2～0.8）μm×（0.5～5）μm，也有的有1个以上螺旋并可长达8μm，较长的可有4～5个弯曲。菌体一端或两端有单根鞭毛，鞭毛长度为菌体的2～3倍，超过48h的培养物以衰老的球菌状居多。具有O（菌体）、H（鞭毛）和K（荚膜）3种抗原。

1.1 空肠弯曲杆菌

1.1.1 形态和染色特性

该菌形态特征同属的描述，一般大小为（0.3～0.4）μm×（1.5～3.0）μm，暴露于空气后很快形成球形体。革兰氏染色阴性，但不易着色，用石炭酸等染色剂或吉姆萨染色更好。

1.1.2 培养和生化特性

在需氧和厌氧环境中不生长，对微需氧条件要求较高，最适生长的微需氧条件为含5%氧、85%氮和10%二氧化碳的混合气体环境。培养适宜温度为42～43℃，最适宜温度为42℃，37℃可生长，30℃以下不生长。可生长pH为7.0～7.9，最适pH为7.2。

该菌在双相培养基中生长良好。常用固体培养基为Skirrow培养基、Butzler培养基和改良Camp-BAP培养基，我国常用Camp-BAP培养基。在固体培养基上经48h培养后，可形成两种类型的菌落：第一型菌落不溶血，灰色，扁平，润湿，有光泽，看上去像水滴，边缘不规则，常沿划线生长；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径1～2mm），边缘整齐，半透明，有光泽，中心稍混浊。在液体培养基上轻微混浊生长，常有油脂状沉淀，不易散开，在麦康凯琼脂上生长微弱或不生长。常用液体培养基有改良布氏肉汤、硫乙醇酸钠肉汤。

该菌不发酵糖类，不分解尿酸，不液化明胶。甲基红（MR）试验、吲哚试验均为阴性。

1.1.3 抵抗力

该菌对氧敏感，故在外界环境中很容易死亡。对干燥抵抗力弱。对酸和热敏感，pH2～3经5min、58℃经5min可灭活。对常用消毒剂敏感，如3%来苏儿、1%新洁尔灭、双氯苯双胍己烷和度米芬等。经紫外线5min不耐受。

1.1.4 抗原性

具有耐热的O（菌体）、不耐热的H（鞭毛）和K（荚膜）3种抗原。鞭毛轴丝蛋白是空肠弯曲杆菌的一种共同抗原成分，该抗原只有在酸处理下才显露出来，具有热稳定性，其免疫原性很强；外膜蛋白也是引起菌株间交叉反应的共同抗原成分。该菌的分型方法较多，主要有依据O抗原的间接血凝分型法和依据H和K抗原的玻片凝集分型法。

1.2 胎儿弯曲杆菌

1.2.1 形态和染色特性

该菌细胞两端变尖，一般幼龄时较短，大小为（0.2～0.3）μm×（1.5～5.0）μm，老龄的较长。为8μm以上弯曲螺旋的丝状体，有时可见球形，无芽孢和荚膜，一端或两端具有鞭毛，有运动

1.2.2 培养和生化特性

该菌微需氧，最适生长的微需氧条件为含5%氧、85%氮和10%二氧化碳的混合气体环境。在严格厌氧条件下微弱生长或不生长。最适宜生长温度为37℃，25℃可生长，42℃一般不生长。最适pH为7.0。

培养要求条件较高，常用血琼脂平板培养基和布氏肉汤培养基。在普通琼脂培养基上，初次分离可形成光滑型、粗糙型、雕花玻璃型及黏液型菌落，最常见的是光滑型菌落，粗糙型菌落很少见。在血琼脂平板培养基上菌落呈灰白色，不溶血。在布氏肉汤中有轻微均匀浑浊。在麦康凯培养基上生长微弱。

1.2.3 抵抗力

该菌抵抗力不强，干燥条件下易存活，直射阳光及微弱的消毒剂可将该菌杀死，58℃经5min可灭活。

1.2.4 抗原性

应用热处理菌细胞法（100℃2h）进行该菌的血清学分型。胎儿弯曲杆菌包括胎儿和性病两个亚种，胎儿亚种可划分为血清型A-2和B，有些菌株具有两种抗原（A-B-2），这些血清型含有热稳定的

表面抗原A和B；性病亚种可划分为A-1和A-亚1，这些血清型含有热稳定的表面抗原A。

2 流行病学特征

胎儿弯曲杆菌病流行范围较广，世界各国均有流行，阳性率在温暖季节较寒冷季节高，多见于7—9月。人类弯曲杆菌病暴发前存在周期和时间段的不同。

弯曲杆菌广泛存在于鸟、禽、猫和犬等多种动物体内，从牛奶、蟹肉、河水和无症状人群粪便中可分离到该菌。健康的鸡和奶牛也携带弯曲杆菌。弯曲杆菌已涉及的食品有生的和未煮熟的鸡、生的和巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制品、生火腿等。

空肠弯曲杆菌是人类散发性细菌性肠炎最常见的菌种之一，带菌动物是主要传染源，动物宿主非常广泛，特别是鸟类，通过粪便污染各种水源，造成感染的循环。家畜特别是奶牛感染后，还可通过乳汁排放病菌。人类感染主要通过饮食或与感染动物直接接触。市售鸡肉污染率至少60%，在发达国家的人类感染由烤鸡引起。大多数感染为散发性。污染的牛奶和水是造成暴发性流行的主要原因。与沙门氏菌不同，空肠弯曲杆菌不在食物中繁殖，很少引起暴发性食物中毒。空肠弯曲杆菌感染可发生在人类的任何年龄段，但发病率在中、青年较高，潜伏期一般为3～5d。

胎儿弯曲杆菌胎儿亚种致绵羊流产和牛的散发性流产，也可感染人引起流产、早产、败血症及类似于布鲁氏菌病的症状。胎儿弯曲杆菌除存在于流产绵羊和牛的胎盘及胎儿胃内容物中之外，还存在于感染母牛和羊的血液、肠内容物、胆汁以及人体许多部位的血液、脑脊液和脓肿之中，胎儿弯曲杆菌可在人和动物的肠道和胆囊中生长。

3 危害

弯曲杆菌是一种重要的人畜共患病的病原菌，常引起家畜腹泻、流产，禽类肝炎和蓝冠病，还可引起人类急性肠炎、格林-巴利综合征、反应性关节炎、Reiter’s综合征等多种疾病，人类常因摄入被弯曲菌污染的食物和饮水而感染。

对人类致病的主要是空肠弯曲杆菌和胎儿弯曲杆菌胎儿亚种。前者是人类腹泻最常见的病原菌之一；后者可感染人，是引起婴幼儿急性腹泻的重要病原菌之一，也引起流产、早产，以及在免疫功能低下时可引起胆囊炎、腹膜炎、肺部感染、脑膜炎甚至败血症等。

弯曲杆菌在胆管中生长，小肠上端微需氧环境适宜该菌生存和繁殖，造成空肠、回肠和大肠组织损伤，通过肠黏膜侵入血液。空肠弯曲杆菌感染称为弯曲杆菌病，临床表现为发热、腹泻、呕吐和肌肉痛。潜伏期平均3～5d，病程7～10d。发病1～2d后，粪便的特征是带血，镜检中有多形核白细胞，重症病例也有水样血便、黏液性粪便，常误诊为急性溃疡性肠炎。该菌感染可自然恢复，抗生素能进一步限制感染病人粪便中细菌的存活时间。

在腹泻患者粪便中，该菌的分离率大大高于沙门氏菌。研究表明，该菌少至500个也可致病，但很少发生死亡，病死率为千分之一。最易感人群是5岁以下儿童和15～29岁的青年。

弯曲杆菌属特别是空肠弯曲杆菌是引起人类急性肠炎和腹泻的重要病原菌，对人类的健康构成了比较严重的威胁和危害。在2006年，弯曲杆菌病是欧盟报告最多的人的动物源性人畜共患病，共有175561例，比2005年有小幅度降低。弯曲杆菌是在新鲜的家禽肉中最常检出的细菌，平均有35%的样品呈现阳性。活家禽、猪和牛也常检出弯曲杆菌。

英国食品安全局于2010年7月27日发布了一份关于如何采取措施减少英国境内生鸡感染弯曲杆菌的报告，但由于弯曲杆菌所导致的食品安全事件仍有发生。英国食品安全局2016年年初公布报告，英国超市种购买的新鲜鸡肉七成可能携带空肠弯曲杆菌，每年感染约28万英国人。2006年5月，新西兰的人弯曲杆菌病流行达到顶峰。该年度报道发病率首次突破每10万人400例，是新西兰历史上最高的人弯曲杆菌病发病率。据估计，新西兰人弯曲杆菌病的流行每年至少造成1人死亡、800人住院，超过10万个社区发现该病病例，每年引起的经济损失达7500万美元。

4 检测方法

4.1 细菌分离鉴定

4.1.1 样品处理与增菌

4.1.1.1 碎牛肉

称取25g样品，置于均质杯内，加入100mL含有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的弯曲杆菌增菌肉汤，用均质器以8000～10000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布，倒入一个容量为250mL的三角烧瓶中，置含有5%氧、85%氮、10%二氧化碳混合气体的微需氧条件下，42℃培养24～48h。

4.1.1.2 净膛全禽和分割禽肉

用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min。取肉汤，经灭菌纱布过滤，于23000g、4℃离心20min，或于16300g、4℃离心30min，弃去上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的弯曲杆菌增菌肉汤中。培养方法同4.1.1.1。

4.1.1.3 牛奶

称取约40g牛奶放入离心管中，按4.1.1.2中的方法离心。弃去脂肪和上清液，将沉淀物混悬放在250mL三角烧瓶中的100mL加有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的弯曲杆菌增菌肉汤中。培养方法同4.1.1.1。

4.1.1.4 贝类

将100g样品和100mL加有利福平、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐、多黏菌素、放线菌酮的抗生素溶液的增菌肉汤放入均质杯中，用均质器以8000～10000r/min转速均质30s。用灭菌纱布将上述均质液过滤。取50mL滤液放在500mL三角烧瓶内的200mL增菌肉汤中。培养方法同4.1.1.1。

4.1.1.5其他食品

所使用的增菌方法决定于食品的种类。虾、整尾海鱼和海鱼片经4.1.1.2处理后，用加有利福平、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐、多粘菌素、放线菌酮的抗生素溶液的增菌肉汤增菌。羊肉和猪肉块可先用表面洗涤法处理，再用加有万古霉素、三甲氧苄氨嘧啶乳酸盐和多黏菌素抗生素溶液的肉汤增菌。碎肉按4.1.1.1所列方法处理。液体食品按4.1.1.3所列方法处理。各种样品的培养方法均同4.1.1.1。

4.1.2 分离和初步鉴定

取5mL经24～48h增菌的培养物，以0.65μm孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物，分别在分离用改良Skirrow氏培养基平板上划线接种，将平板置以上微需氧条件下42℃培养24～48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色（可能出现浅红色）凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片，用相差（或暗视野）显微镜检查。如果湿片镜检动力明显、呈快速的螺旋样运动，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，形状如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形、海鸥展翅形或螺旋状，可初步鉴定为弯曲杆菌。挑取初步鉴定为弯曲杆菌菌落，在布氏琼脂上划线做纯分离。培养方法同上。根据生化试验和抗生素敏感性试验进行菌株证实。

4.1.3 确定诊断

4.1.3.1 生化试验

从纯分离平板上挑取2个典型菌落，分别接种于布氏肉汤中，置微需氧条件下42℃培养24～28h。同时接种一份已知阳性培养物作为对照。继续置5%氧、85%氮、10%二氧化碳微需氧条件下做以下试验。

生长试验：接种3管含0.002%中性红（NR）的含0.18%琼脂的布氏肉汤基础培养基，其中1管置37℃培养，检查在这一温度下的生长情况，并用于观察过氧化氢酶反应。另2管分别置42℃和25℃培养，每日检查生长情况，对未生长者需培养5d，方可做出最后判断。

1%甘氨酸中生长试验：将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基上。置空气中于37℃培养。每日检查生长情况，对未生长者需培养5d，方可做出最后判断。

3.5%氯化钠中生长试验：将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基上。置空气中于37℃培养。每日检查生长情况，对未生长者需培养5d，方可做出最后判断。

过氧化氢酶试验：滴加3%过氧化氢溶液于显示有细菌生长的试管内，出现气泡者为阳性反应。

氧化酶试验：使用琼脂平板表面经24h微需氧培养生长物，将氧化酶试剂滴于棉拭子上，并用棉拭子去接触表面生长物。在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。

硝酸盐还原试验：将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基上。置空气中于37℃培养5d。加入亚硝酸盐检测试剂，出现红色者表明硝酸盐被还原成亚硝酸盐，为阳性反应。

硫化氢产生试验：将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基上，将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部，旋紧试管帽。置空气中于37℃培养。每日检查，观察滤纸条是否变黑，纸条变黑表明有硫化氢产生，为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d，方可做出最后判断。

马尿酸盐水解试验：用接种环取一满环在琼脂平板上培养过夜的生长物，接种于1%马尿酸钠溶液中，置37℃水浴中放置2h。在每个试管中加入0.5mL茚三酮试剂，将试管于室温下放置2h，出现紫色者为阳性反应。

4.1.3.2抗生素敏感性试验

用灭菌棉拭子将预先准备的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板上。将含头孢噻吩（30μg）和萘啶酸（30g）的圆纸片分别贴于平板表面。置微需氧条件下于37℃培养24h，检查有无抑菌圈。

4.1.3.3 鉴别诊断

根据表2-8对细菌做出鉴定。

4.2 免疫学诊断方法

免疫学诊断是一种应用广泛且敏感性高的诊断方法，可应用于弯曲杆菌病诊断的方法主要有：

4.2.1 凝集试验

主要是检查被检样品中的抗体效价。将待检样品离心取上清液，并稀释成不同比例，向其内加入已知抗原，观察凝集效应，凝集效价达1∶100者，可判为阳性。但血清抗体效价较阴道黏液出现时间迟，其维持时间也不如后者长，故效果不如阴道黏液凝集试验满意。该方法主要应用于流产牛弯曲杆菌病的诊断。

4.2.2 间接荧光抗体法

用待检样品加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃孵育30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。再加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。具体步骤：

（1）滴加0.01mol/L、pH7.4的PBS于已知抗原标本片上，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。

（2）滴加以0.01mol/L、pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷湿盒内，37℃保温30min。

（3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L、pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L、pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。

（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加1滴一定稀释度的荧光标记的抗球蛋白抗体。

（5）将玻片平放在有盖搪瓷湿盒内，37℃保温30min。

（6）重复操作（3）。

（7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加1滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

（8）荧光显微镜高倍视野下观察。

为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰：

标本自发荧光对照：标本加1～2滴0.01mol/L、pH7.4的PBS。

特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4.2.3 间接ELISA检测法

间接ELISA是ELISA的一种，是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体。也有相关文献报道该方法可用于检测弯曲杆菌，具体步骤如下：

（1）用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/mL，每孔加0.1mL，4℃过夜。次日洗涤3次。

（2）加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1mL，37℃孵育30～60min，洗涤。

（3）加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。

（4）终止反应于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。

（5）结果判定可于白色背景上直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”“－”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色剂显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍即为阳性。

4.3 分子生物学方法

4.3.1 DNA探针检测方法

核酸（DNA）探针方法是一种非常重要的分子生物学方法，已广泛用于流行病学调查和临床诊断，此方法不仅敏感、特异，而且快速、经济。李广兴等应用地高辛标记核酸技术将地高辛结合到弯曲杆菌的基因组DNA上，制备了地高辛标记的DNA探针。该探针可特异地与空肠弯曲杆菌发生反应。具体操作步骤如下：

（1）弯曲杆菌DNA的提取取弯曲杆菌标准菌株培养物以TE缓冲液洗脱后，然后将菌体悬浮于TE缓冲液中，再于4℃下3500r/min离心15min，弃上清液，收集菌体并悬浮于适宜的TEＧ蔗糖缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度为10mg/mL，37℃水浴振荡1h；加入十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度为1%，50～60℃振荡30min，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），振荡30min，5000g离心10min，吸取上层水相，用同样方法再抽提一次，用无水乙醇沉淀DNA，脱水干燥后溶于1mLTE缓冲液中，用紫外分光光度计测定DNA的浓度，－20℃保存备用。

（2）核酸探针制备取上述提取的弯曲杆菌DNA20μL加入1mL去离子水，超声波裂解处理，每隔2min取裂解样品10μL，常规琼脂糖凝胶电泳，选取电泳谱带较为集中且在05～1kb的裂解样品，经乙醇沉淀，脱水干燥后溶于去离子水中；然后按地高辛DNA标记和检测试剂盒说明进行核酸标记。

（3）DNA探针斑点印迹检测包括点样、预杂交、杂交和杂交检测。

点样：取大小适度的硝酸纤维膜（NC膜），先用去离子水浸透，再置于20倍柠檬酸钠缓冲（SSC）溶液（3mol/L氯化钠，0.3mol/L柠檬酸钠）中浸泡30min，然后置于滤纸上，37℃温箱中烘干。取变性后的待检样品10μL点样于该NC膜上，室温干燥后再置80℃温箱中烘干固定2h。

预杂交和杂交：将点样膜装入20mL预杂交液（20倍SSC、0.1%十二烷基肌氨酸钠、0.02%SDS、1%封闭液）的塑料袋中，将袋封口，置68℃、转速为5r/min的转鼓内预杂交8h，倒掉预杂交液，加入杂交液（预杂交液中加入适当浓度的变性探针）置68℃杂交过夜。

杂交检测：取出杂交后的NC膜，用2倍SSC、0.1%SDS溶液，37℃洗膜2次，每次5min；用0.1倍SSC、0.1%SDS溶液，37℃洗膜2次，每次15min；接着在缓冲液Ⅰ（100mmol/L的Tris-盐酸、150mmol/L氯化钠，pH7.5）中短暂洗膜1次，然后封闭液37℃作用2h；用缓冲液Ⅰ短暂洗膜1次，再将NC膜放入缓冲液Ⅰ稀释的抗体结合物溶液（抗体浓度为75mU/mL）中作用1h；用缓冲液Ⅰ洗膜2次，每次15min；用缓冲液（100mmol/L的Tris-盐酸、100mmol/L氯化钠，50mmol/L氯化镁，pH9.5）洗涤2min，加入底物溶液（4μL/mL硝基蓝四氮唑、3.5μL/mL5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐）进行显色。当阳性对照点显示出颜色时，用TE缓冲液洗膜，终止反应。点样处出现紫蓝色为阳性杂交信号。

4.3.2 PCR

根据GenBank上公布的弯曲杆菌基因序列中的保守片段，应用Premier5.0软件设计和合成特异性引物。对被检样品进行增菌、纯培养处理，取纯培养菌株抽提DNA，制备DNA模板；按照常规PCR进行扩增，得到扩增序列后测序，与公布的序列进行同源性比对。