液相色谱仪的组成及各部分的作用(专业液相色谱（HPLC）基础知识)

Posted 2023-06-01

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液相色谱仪的组成及各部分的作用(专业液相色谱（HPLC）基础知识)

Waters Alliance 高效液相色谱

一、概述

1、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \\ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

2、什么是色谱

色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法

常见的分离方法：蒸馏，离心，电泳，过滤，超滤。

目前最有效的分离方法：色谱

3、色谱法(Chromatography)溯源100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)1906年正式命名(见诸文献)20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代

二、HPLC原理

1、正相色谱（normal phase）n流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:n氨基柱、氰基柱、硅胶柱。n常用流动相为极性小的有机溶剂。2、反相色谱（reversed phase）n流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有：ODS( C18)，C8，C2。n常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。

3、空间排斥色谱（stericexclusion）n也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。凝胶渗透——以有机溶剂为流动相凝胶过滤——以水溶液为流动相对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。

二、HPLC色谱系统

高效相色谱流程图

流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分按极性分：极性、弱极性、非极性按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱

水

配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为0.055 μS/cm的超纯水，并通过0.22 μ m的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。

溶剂

色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）

试剂分析纯

过滤：0.45μm或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。
脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡，
气泡对测定的影响：

1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积

2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形

3）检测器中的气泡产生基线波动

流动相的保存

有机溶剂流动相

室温下密封，避光保存

缓冲盐流动相：

当日现配现用：低温下密封保存，一般不超过5天,防止微生物生长

有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：

低温密封保存防止有机相的挥发

选用适宜的容器

氨基柱

氨基键合相：硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2]即可作为正相柱也可作为反相柱
可以用于分离单糖、双糖类物质：如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等，一般要用示差检测器进行检测
分离条件为：乙腈和水，其中乙腈的比例为70%-85%，pH=2~11
保存方法：用纯乙腈保存
注意：氨基柱很脆弱，长时间走水相会使氨基水解

C18柱（反相色谱柱）

键合相：

C18柱是液相色谱中最常见的一种色谱柱，可以用于分离非极性到中等极性的有机化合物
分离条件为：甲醇、乙腈、水、缓冲溶液，pH=1-12
保存方法：用纯乙腈保存
注意：C18柱相对于氨基柱来说使用寿命会长一点，柱子一定不能走纯水，缓冲盐浓度在20mmol/L以下

水溶性凝胶色谱柱

填充物：羟基化的聚甲基丙烯酸甲酯
可以用于分离水溶性多糖和水溶性聚合物大分子
分离条件为：水
保存方法：0.5%的叠氮化钠水溶液保存
注意：不能走有机溶剂

三、高效液相色谱法的实验流程

（1）准备流动相，配制好sealwash 和ndwash的溶液，并进行脱气处理

（2）开机前要检测各部件连接是否完好，然后打开HPLC的各个部件的电源，等待HPLC自检通过，用上述溶液清洗

（3）对泵进行dryprime、wetprime操作，排出管路中的气体，让流动相充满管路

（4）安装相应的色谱柱，用合适的条件对系统进行平衡

四、仪器保养与维护

色谱柱的保养

柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；
当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；
要注意流动相的脱气；
避免使用高粘度的溶剂作为流动相；
进样样品要提纯；
严格控制进样量；
每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；
每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；
若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；

HPLC部件的维护

吸滤头 5%稀硝酸超声清洗15min，再用纯水冲洗干净
单向阀甲醇超声15min左右，再用纯水冲洗干净
在线过滤器 5%稀硝酸超声清洗15min，再用纯水冲洗干净

HPLC的泵的保养：使用流动相尽量要清洁；进液处的砂芯过滤头要经常清洗；流动相交换时要防止沉淀；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染

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