液相色谱(一文读懂液相色谱（HPLC）)

Posted 2023-06-01

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液相色谱(一文读懂液相色谱（HPLC）)

一、原理

在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。

色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。

使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。

由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

二、应用

1、在食品研究中的分析应用

（1）食品中的天然成分

碳水化合物

类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸

（2）食品添加剂

酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂

颜料和染料(色素〕

维生素

（3）污染物

霉菌(黄曲霉毒素)

农药和兽药残留

多环芳烃（PAHS）和亚硝酸

2、在医药研究中分析应用

药物分析有USP、BP、CP等标准

常用药物研究中的应用:解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。

甾体药物研究中的应用:肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。

抗菌素类药物研究中的应用:青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。

中草药研究中的应用:生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类

手性药物研究中的应用:光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强)

医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。

3、在生物化学和生物工程中的应用

（1）氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究

核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究(儿茶酚胺类)

（2）在精细化工分析中的应用

醇、醛和酮、醚的分离分析

酸和酯的分离分析表面活性剂的分析聚合物的分析研究

药物、农药、染料、炸药等工业产品在无机离子分析中应用

饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析

4、在公安、刑警破案工作需要毒品分析等

（1）在环境污染分析中的应用

（2）废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留酚类和胺类的检测

三、液相色谱图相关术语

色谱峰-Peak

色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线

峰底-Peak Base

峰的起点与终点之间连接的直线

峰高 - Peak Height

峰最大值到峰底的距离

峰宽-Peak Width

在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离

半(高)峰宽-Peak Width at Half Height

通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离

峰面积-Peak Area

峰与峰底之间的面积,又称响应值

标准偏差;σ-Standard Error

0.607倍峰高处所对应峰宽的一半

拖尾峰 - Tailing Peak

后沿较前沿平缓的不对称峰

前伸峰- Leading Peak

前沿较后沿平缓的不对称峰

鬼峰- Ghost Peak

并非由试样所产生的峰;亦称假峰

基线-Baseline

在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线

基线飘移-Baseline Drift

基线随时间定向的缓慢变化

基线噪声:N-Baseline Noise

由各种因素所引起的基线波动

谱带扩展- Band Broadening

由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象

死时间to-Dead time

不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间

保留时间，tR-Retention time

组分从进样到出现峰最大值所需的时间

死体积，Vo-Dead volume

不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积

保留体积，VR-Retention volume

组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积

四、常见问题与其对策

1、液相色谱常见问题类型

A.压力异常(偏高、波动)

B.漏液

C.保留时间漂移

D.基线问题(漂移、噪声)

E.峰形异常

2、现象:无压力，流动相不流动可能原因

（1）保险丝断或电源问题

（2）柱塞杆折断

（3）泵头内有空气或流动相不足(常见)

（4）单向阀损坏

（5）漏液(常见)

（6）压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)

3、现象:压力偏高

（1）流速设定过高

（2）保护柱或柱子筛板堵塞(常见)

（3）流动相使用不当或有缓冲盐析出

（4）线路过滤器堵塞(常见)

4、压力偏低

（1）流速设定过低

（2）柱温过高

（3）系统漏液

5、现象:压力波动可能原因

（1）泵头中有气泡

（2）脱气不充分

（3）系统漏液

（4）单向阀脏

（5）柱塞密封圈损坏

6、漏液

（1）接头处松动(柱接头及其它管路接头)

（2）接头磨损(peek头)

（3）泵密封损坏(泵单元)

（4）转子密封损坏(进样单元)

（5）流通池垫片或透镜损坏(检测器)

7、保留时间漂移

（1）柱温变化

（2）流动相组分变化

（3）色谱柱没有平衡

（4）流速变化

（5）泵中有气泡

（6）流动相选择不当

（7）键合相流失(柱效降低)

8、基线漂移问题

（1）温度波动

（2）流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)

（3）流动相污染，变质

（4）柱子正在平衡

（5）样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出

（6）流通池被污染或有气泡

9、基线噪声大

（1）流动相、泵、检测器中有气泡

（2）流动相污染、变质或由低质溶剂配成

（3）有地方漏液

（4）流动相各溶剂不相溶或混和不均匀

（5）流通池污染

（6）检测池能量不足

（7）系统内有气泡

（8）其他电子设备的影响

10、峰形异常（前沿峰、拖尾峰）

（1）柱塞板堵塞

（2）色谱柱塌陷

（3）干扰峰

（4）样品溶剂选择不当

（5）样品过载

（6）柱温过低

11、峰形异常（分叉峰）

（1）保护柱或分析柱污染

（2）色谱柱塌陷

（3）样品溶剂不溶于流动相或极性相差很大

（4）样品浓度过高

12、峰形异常（峰展宽）

（1）进样体积过大

（2）流动相粘度过高

（3）保留时间过长

（4）柱外体积过大

13、峰形异常（峰变形）

（1）样品过载

（2）样品溶剂选择不当

14、峰形异常（鬼峰）

（1）进样阀残余峰

（2）样品中未知物

（3）柱未平衡

（4）水污染

五、分离模式

液相色谱柱种类繁多，在精准选择液相色谱柱之前，首先必须选择HPLC的分离模式，根据使用的固定相和流动相的组合不同，可以得到下列各种各样的分离模式。

六、了解样品

了解待检样品的结构、分子量、溶解性、离子化、极性、pH值等物理化学性质，再参照下图选择适合的分离模式和精准的液相色谱柱固定相：