液氮研磨机(10年做出这项原始创新成果无小刺鱼诞生全揭秘)

Posted 2023-06-01

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液氮研磨机(10年做出这项原始创新成果无小刺鱼诞生全揭秘)

文 | 《中国科学报》记者赵广立

吃鱼被鱼刺卡喉，是众多食客的切肤之痛。但太不巧的是，我国的主养鱼类如青草鲢鳙鲤鲫鲂，都存在一定数量的肌间刺——即遍布于鱼背、鱼尾等处恼人的“小刺”。

这些鱼能不能不长小刺？这在以前，是天方夜谭；但现在，这个“无理要求”有望成为现实。

华中农业大学水产学院教授高泽霞，现在是名副其实的鱼类肌间刺研究专家。今年，她领导的研究团队发现了决定鱼类肌间刺形成的关键基因，并先后利用基因编辑手段，获得了无小刺的斑马鱼（模式鱼类）和武昌鱼（主养经济鱼类，学名团头鲂）。未来，该技术突破还有望成功应用到鲫鱼、鲤鱼乃至青、草、鲢、鳙等重要经济鱼类。

这项创新性成果的背后，是高泽霞团队历时十年之久的苦苦求索。更值得称道的是，自开展无小刺鱼研究以来，团队从2012年到2021年间仅拿到4项共计170万元的经费支持，加上2021年刚获批的一个250万元的项目，前后也仅有420万元经费支撑。

靠有限的经费资助，高泽霞团队是怎样一步步做出这项原始创新成果的？一切要从十年前的“无心插柳”说起。

有肌间刺武昌鱼

无肌间刺武昌鱼

这根“刺”，如鲠在喉

2010年6月，高泽霞从华中农业大学毕业，获得农学博士学位。那时，她所在的团队主要关注武昌鱼的生长、抗病和耐低氧性状。但逐渐地，“让武昌鱼长快一点、长大一点”“抗病能力和耐低氧能力强一点”这些研究，让高泽霞觉得有点“不过瘾”。

“长得快、抗病、耐低氧的问题解决之后，武昌鱼的价格还是抬不上来。为啥？鱼刺多，让很多消费者望而却步。”她对《中国科学报》说，卡喉之痛让人不胜其烦，肌间刺的存在严重影响了鱼类的食用和加工价值。

肌间刺这根“刺”，让高泽霞如鲠在喉。

她开始查文献，发现之前也有学者关注过这个问题，但只是零星的探讨，并没有深入的研究。

不让武昌鱼长出肌间刺，理论上讲，如果能找到肌间刺形成的主控基因，是可以通过基因编辑技术实现的；但更重要的问题是，不长肌间刺的武昌鱼能否正常生长？

高泽霞想到，在鱼类的进化过程中，有的鱼类的小刺变软退化，有的鱼类如鲈形目的鲈鱼、鲇形目的黄颡鱼都没有肌间小刺……她觉得，单凭这个，就值得一试。

中科院水生生物研究所研究员徐旭东告诉《中国科学报》，在鱼类的演化史上，小刺经历了逐渐增多、形态趋向复杂，之后又逐渐减少、消失的过程。他说，低等真骨鱼类如鲱形目、鲤形目，小刺较多，而较高等的鲈形目则完全消失。但不幸的是，被国人选中的主养鱼种刺很多，那些无小刺鱼类一般养殖成本较高，或者“娇气不好养”，在产量上难以与常见的7大主养鱼相匹敌。

除了产业价值，这项研究背后也有科学价值。高泽霞对记者表示：“我们的父母长辈包括我自己也有腰椎间盘突出的问题，研究肌间刺还跟了解骨质增生（俗称“骨刺”）有点关系。”综合因素下，她决定瞄准鱼类的肌间刺剔除一探究竟。

理想很美，但真做起来的时候她才发现，无从下手。

“当时没人能告诉你应该怎样开展这项工作；查阅生物信息数据库，也没多少肌间刺相关的遗传资源——大都是表型方面的：肌间刺什么时候长、骨化顺序如何等。”高泽霞说：“这也是当时为什么这类项目很难申请到经费的原因——没有研究基础、没有预期结果，确实让人很难办。”

不过，探索的种子已经在心里扎了根，高泽霞坚持要试一试。没有正式项目支持，就借着实验室研究武昌鱼的便利，先从基础工作慢慢做起。

“挑刺儿”是个功夫活

高泽霞从最基本的形态学开始做起，然后再设法去构建肌间刺的遗传资源——肌间刺形成到底是哪些基因表达在发挥作用？哪个或哪几个基因是关键基因？

“要想知道梨子的味道，就得亲口尝一尝。”问题的答案，高泽霞决定把它们一个个“挑”出来。

这个“挑”，是“挑刺儿”的“挑”。

一条性成熟的武昌鱼约有120多根肌间小刺（注：有个体差异，普遍数量为 84~146根），每根小刺都刺入肌肉组织内部，且周围有结缔组织黏连。高泽霞要做的，就是要把这120多根肌间刺从活鱼身上挑出来，提取高质量的转录组RNA，进而探究肌间刺发生与基因表达之间的关系。

这绝对是个有难度的技术活儿。要挑刺儿，首先就得清楚知道这120多根肌间刺都分布在哪里，接着要从被麻醉的活鱼身上，把这些跟结缔组织黏连的肌间刺干净利落地拔起，不能拖泥带水；拔出后，还要迅速除掉外周的肌肉组织，赶在RNA降解之前放进液氮中研磨，使骨组织充分分解，进而提取高质量的RNA。

高泽霞与学生

高泽霞带着学生一挑就是三个月；三个月后，她的眼睛看哪里都好像有根刺。

熟能生巧，几个月后她挑刺拔刺的功夫炉火纯青。在这件事中，她总结了一个道理，经常讲给组内的学生：做科研要敢想，敢想还要敢做，敢做还要敢于坚持做、锲而不舍地做，要有毅力和耐心。

“为什么这么说？因为做难题很容易失败，我们经历了太多次失败。”高泽霞跟《中国科学报》说，从那之后，高质量地挑刺、拔刺，成了课题组每个学生必备技能之一。

这套“挑刺”程序也改进了提取RNA的方法，实现了世界上第一次全面鱼刺基因表达，高泽霞据此申请了鱼刺研究的第一个国家专利。她透露，这套方法，后续被许多研究人员借鉴、引用。

做肌间刺前几年，“没有人员费”

“挑刺”这关一过，课题组建立了很大信心：从这个过程中，他们已经知道了肌间刺里都有哪些基因在表达。高泽霞还带着团队把肌间刺外周的结缔组织、肌肉组织也分离出来，试图找到它们之间基因表达的差异。

严格来说，肌间刺也是鱼的骨骼。研究团队想要搞清楚肌间刺与鱼的其它骨骼组织相比，在组织结构上、基因表达上都有什么差异？

另外，鱼的肌间刺并不是生来就有的。比如武昌鱼的肌间刺是在孵化后十五六天才开始生长、大概50天后全部长齐，那么从没有长刺到长第一根刺开始，再到所有的刺长齐、变长、变大的过程中，分别是哪些基因在发挥作用？

高通量测序技术（第二代测序技术）的快速发展，为肌间刺基因资源的挖掘带来了契机。之后，单细胞测序技术（第三代测序技术）也逐渐获得应用。有了细胞水平的测序手段，高泽霞还想弄明白，为什么肌间刺的前身——肌腱细胞会向成骨细胞分化？

通过对武昌鱼肌间刺发生、发育不同时期的转录组、mRNA组、蛋白组等多组学分析，加之对比肌间刺组织与其他骨骼组织的基因、蛋白表达的差异性分析，高泽霞研究团队逐步弄清楚了调控武昌鱼肌间刺生长发育的基因作用，并筛选、鉴定了一批（约60个）关键候选基因。

调控肌间刺发育的主效基因就藏在这些候选基因中。换言之，只要找对了关键基因，就可以通过基因编辑技术，逐步构建无肌间刺的武昌鱼。

无肌间刺武昌鱼，6个月、250g

这里不得不提的是，在做这些研究时，高通量测序和单细胞测序的费用不菲。而高泽霞2012年刚开始“没有一分钱来做这事”，直到2015年才拿到由华中农业大学提供的第一笔10万元青年自主创新基金；三年后成果有望，2018年才从学校拿到第二笔30万元项目基金。

做这件事，高泽霞得到了导师、华中农业大学教授王卫民的全力支持。用她的话来说，实验室正常的运转全靠导师及自己主持的其他项目维持，她和学生们做武昌鱼肌间刺，没有人员费、基础耗材费等经费支撑。

“完全没有肌间刺，才有意义”

候选基因在手，高泽霞带领团队开始用模式鱼类——斑马鱼来筛选主导鱼类肌间刺发生发育的关键基因。鲤形目的斑马鱼只需3个月就能性成熟，用它来做基因筛选，能够尽快看到敲除掉不同基因后鱼儿的“长刺表现”。毕竟，等待着他们筛选的潜在基因有60多个。

60多个基因的逐个排除、验证，找到关键主效基因工作量巨大。尽管有心理预期，但高泽霞自己也没想到，竟花了长达四五年时间。

期间，研究团队也有一些动摇：培育一些少刺鱼是不是也可行呢？毕竟少长刺也比许多小刺强。这样是不是也可以算作改良育种？但思忖再三，高泽霞觉得还要继续找下去。

“只做一半算怎么回事儿？”她对《中国科学报》说，无论是对消费者还是对养殖业而言，“完全没有肌间刺，才有意义”。

这几年里，高泽霞抗住了里里外外的许多压力。

在学校，有同一学院的老师觉得做无肌间刺武昌鱼不靠谱，她会陪着笑脸跟老师们解释；出去作报告，讲她打算“死磕”无刺鱼，也经常听到质疑的声音；她的学生用无小刺鱼的研究方向开题，有生态等方面的评审专家觉得这事儿不值得做、做不成功，在开题报告答辩会上直接“劝退”。学生悻悻地找到她，她还要强打起精神给学生鼓劲儿。

“越是有质疑的声音，我越有动力，一定要把无肌间刺的武昌鱼做出来。”高泽霞说。

备受质疑但也常受鼓舞。2015年，徐旭东以全国政协委员、水生生物专家的身份，在科学网博客发表题为《中国应培育无小刺主养鱼》的博文，作为他建言相关部门设立“原始创新基金”和“原始创新计划”的生动案例。

文章中，徐旭东提到“中国科学家应当拿出当年攻关杂交水稻制种技术的智慧和勇气培育无小刺主养鱼品种”，他觉得“在中国人的食谱中，动物性蛋白营养有三分之一来自于鱼类”，因此这个动议“并非小题大做”。

高泽霞与徐旭东素未谋面，但得此文如遇知音，也坚定了她做无小刺鱼的决心。

没底气？“大盖巨脂鲤”送助攻

2015年还发生了一则趣事，让高泽霞做武昌鱼肌间刺这件事有了更多底气。

那年她前往西班牙参加世界鱼类遗传育种大会，分享她做鱼刺的故事。会上，有一位巴西学者——University of Mogi das Cruzes的Alexandre Hilsdorf教授也讲述了鱼刺有关的故事，而且有着神奇的色彩。

在巴西有一种名为大盖巨脂鲤的鱼，是当地一种主要养殖鱼类，属于脂鲤目，也长着上百根肌间刺。偶然的一天，这位学者接到一个养殖户的电话，说他们正在吃一条“一根小刺都没有的大盖巨脂鲤”，请他一定过来看看。

Alexandre Hilsdorf开始不相信有这种事情，但又觉得养殖户不至于拿这件事骗他，琢磨再三之后，坐了三个小时的飞机去一探究竟。

那条鱼确实是一根肌间刺都没有。顾不上想到底怎么回事，他带着透射仪器把这家养鱼场的几千条鱼扫了个遍，还真的发现了十几条完全没有肌间刺的大盖巨脂鲤。

这些无肌间刺的大盖巨脂鲤一样能繁育后代。这位学者不敢怠慢，就用这十几条鱼开始选育，果然培育出了无肌间刺的大盖巨脂鲤。

“大家猜测那些鱼是突变体。”高泽霞告诉《中国科学报》，巴西境内的亚马逊河是全球自然环境条件最为变化多端的一条河流，无论光照、气温、干湿度都有可能创造自然突变条件。

可惜的是，现在他们也还没弄清楚是哪些基因突变导致的。后来，这位巴西学者还把不长肌间刺的大盖巨脂鲤样本送给高泽霞，希望帮助探明背后原因。

但这个故事更令高泽霞激动的是，这个现象表明，原本有肌间刺的鱼类，在失去长刺能力之后，一样可以正常生长、繁育，并且在营养价值和口味方面也没有明显差异。

“这不正好佐证了我们做这件事的意义吗？”高泽霞激动地反问道。

她告诉记者，我国鱼类遗传育种与发育生物学领域知名专家、中国科学院院士桂建芳也吃到过无小刺的武昌鱼。听到这个消息后，她也效仿巴西学者去扫描了几千条武昌鱼，但可惜“运气没那么好”。

不过，桂建芳院士对她带领团队做肌间刺工作非常支持和鼓励，并在研究思路、实验具体方案方面提供了很多指导，这让高泽霞很是感动。

高泽霞（右二）

“无小刺鱼”的故事未完待续

从60多个候选基因中，高泽霞团队先后发现了3个基因在不同程度上调控了鱼类肌间刺的发生发育。

其中，scxa基因功能缺失，能让鱼类肌间刺的数目显著减少70%左右，突变体斑马鱼背部肌间刺完全缺失，仅保留尾部少数肌间刺。但遗憾的是，scxa基因缺失品系也存在肋骨发育缺陷问题。

后来他们发现bmp6基因的缺失也能让斑马鱼肌间刺的数目显著减少30%左右，且其他骨骼组织发育基本正常。

最终他们发现了runx2b基因缺失会导致突变斑马鱼肌间刺完全缺失，且其个体生长、其它骨骼单元形成、肌肉脂肪酸和氨基酸含量等性状均未受到显著影响。

“就真的一根肌间刺都没有。当时我们都不敢相信这是真的，但又真的非常兴奋。”高泽霞难以描述当时的心情。

原来，在runx2b基因之前，他们已经闹过一次“乌龙”。

2018年，一位学生观察后跟高泽霞说，敲除掉scpp5基因的斑马鱼没有长出肌间刺。当时整个课题组都激动得不行，都以为成功了。但当观察了更多敲除掉这个基因的斑马鱼之后，大家又傻了眼：大部分斑马鱼甚至一根刺都没少长。

“那次我们就像坐了一趟过山车，所以发现runx2b基因后，大家觉得有点‘不真实’，变得非常谨慎。”高泽霞笑着说：“大家不能再受一次刺激了。”

几乎检测了实验室所有能检测的敲除runx2b基因的斑马鱼后，大家才长舒一口气。

后来，他们把这个发现发表在National Science Review（《国家科学评论》英文版）上。

在模式鱼类上告捷，马不停蹄地，高泽霞开始带队在武昌鱼上看效果。这一步，也非常关键。

“这个基因在鱼类上高度同源，而且武昌鱼和斑马鱼同属于鲤形目，因此我们有预期，在武昌鱼上会取得同样的效果。”高泽霞说。

当敲除runx2b基因的武昌鱼鱼苗被培育出来、经过“长刺期”，被观察到确实没有肌间刺之后，那种内心的激动仍让高泽霞久久不能平复。

故事到这里还没讲完。

高泽霞告诉《中国科学报》，成果被报道后，许多人找她投资，声称要建厂、开公司。对此，高泽霞特别强调并声明：“无肌间刺武昌鱼的生产性推广，一定要经过严格的试验性养殖评估。对每一代无肌间刺武昌鱼生长指标、肉质等指标也都需要进行细致的评估。并且，需国家层面有关基因编辑培育新品种的制度建立和颁布实施之后，才能考虑进行生产性推广。

“无刺鱼相关的评估工作我们目前正在开展，另外，我们与国内多个团队合作开展了草鱼、银鲫、鲢等重要养殖鱼类的鱼刺形成主效调控基因敲除实验，也取得了一些进展。”高泽霞对记者说，2020年，团队得到了武汉市一项50万元的科技计划支持；2022年，湖北洪山实验室又批复了一笔250万元的支持经费，专门开展肌间刺相关的研究。目前，她也是国家大宗淡水鱼产业技术体系鲂种质资源鉴定与新种质创制岗位专家，有了相对稳定的支持。

“我们今年共获得了300多条完全没有肌间刺的武昌鱼。”这个数字让她有点骄傲：这些鱼是团队取得突破性成果的明证，而且这些鱼，也足够他们开展接下来的工作了。

“现在肌间刺的研究，也是我们的主业之一了。”高泽霞笑着说道。