消除生物利用度的变化(中药配伍减毒增效的现代研究及思考)

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消除生物利用度的变化(中药配伍减毒增效的现代研究及思考)


复方是中医临床上遣方用药的主要形式,配伍是复方精华之所在,其在“四气五味”“七情合和”及“君臣佐使”等药性及配伍理论指导下,各中药饮片通过配伍发挥协同增效和/或拮抗减毒作用[1]。仅从饮片配伍与药效关系的层面研究,很难阐明中药配伍的科学规律,配伍机制的研究正朝物质基础与生物效应相互关联的方向发展。然而,中药体外成分复杂、体内过程繁琐和直接靶标情况不明确等限制了其配伍减毒增效机制的研究[2-3]。且中药配伍后具有多药物、多成分、多靶点与多途径发挥治疗疾病或减轻毒性损害的特点,仅从成分或靶点等单一层面研究中药配伍减毒增效的作用机制,无法全面阐释中药配伍的合理性[4]。因此,如何全面系统地揭示中药配伍减毒增效机制是中药配伍现代化研究亟待解决的难题。

近年来,一些新技术、新策略的提出,极大地推动了中药配伍减毒增效作用机制的研究,如超分子化学研究、相态拆分研究、基于化学修饰/非修饰的直接靶标研究等技术,网络药理学和代谢组学等多学科技术融合研究策略,从新的视角揭示了中药配伍机制,诠释了中药配伍理论的科学内涵。本文通过综述近年来中药配伍机制研究的技术与进展,提出以“体外成分、体内过程、直接靶标”研究为基础,“中药配伍药理机制研究”为目的,从不同角度和不同层面探索中药配伍后的作用机制,并提出以多学科技术融合探索配伍减毒增效机制的现代化研究策略(图1)。

1 基于“体外成分”的中药配伍研究

中药所含活性成分是中药发挥疗效的物质基础,体外成分的复杂变化是研究配伍机制的基础和重点。色谱和质谱及其联用技术已被广泛应用于中药活性成分的定性和定量分析,发现中药配伍后各药味主要通过以下单一或多个反应实现减毒增效作用[5-6]:(1)减少毒性成分的溶出[7-8];(2)促进活性成分的溶出[9-10];(3)生成新的活性物质[11]。通过定性和定量分析研究配伍前后成分的组成及含量变化,可初步阐明中药配伍减毒增效的机制[12],但存在一定局限性。

中药复方在煎煮过程中常伴随一系列复杂的变化,其汤液大多呈现混合相态体系,包括真溶液相、胶体相、混悬相和沉淀相等,中药配伍减毒增效作用不仅由多种相态下的化学成分主导,还与不同释药行为密切相关[13-14]。因此,基于相态分析的方法被引入中药配伍后减毒增效机制的研究中,郭玉岩等[15]发现马钱子与甘草配伍后其毒效成分均有所减少,且主要集中在沉积物相态,由于沉积物相态的缓释作用,可长时间发挥药效,并维持平稳的药物浓度,是实现减毒增效作用的关键。吕邵娃等[16]认为白虎汤纳米相态对解热成分及解毒成分起到了增溶作用,其强效解毒解热作用的机制与纳米粒子的形成有关。

此外,中药复方在煎煮过程中会出现自沉淀现象,传统中医认为自沉淀应与中药汤剂同服,自沉淀是中药配伍科学内涵的外在表象[17]。雷海明团队[18-19]研究发现自沉淀部分存在药效,其作用甚至强于上清液,自沉淀形成机制的研究对中药配伍及合理应用具有重要意义。因此,该团队将超分子化学运用于中药配伍合理性的探究,发现配伍后各成分通过静电、疏水、氢键及π-π等相互作用诱导形成多种超分子体系,达到减毒增效的目的[20-22]。如小檗碱与马兜铃酸在水煎煮过程中产生静电、疏水及π-π堆积的稳定超分子结构,这些结构阻断马兜铃酸的毒性基团硝基和羟基的环化,从而抑制其形成毒性代谢物马兜铃内酰胺,以达到配伍减毒的作用[23]。黄连解毒汤中黄酮苷类有效成分可以与小檗碱于水溶液中在弱键诱导下自组装形成球形和线形超分子,超分子结构的形成会显著影响单体活性,自组装后与前体原料小檗碱相比,对金黄色葡萄球菌的抑制作用和生物膜清除能力明显改变,以达到配伍增效的目的[24]。

成分定性和定量分析法、相态分析法[14,25]和超分子化学法[23-24]均被用于中药配伍合理性研究(图2)。其中,相态分析法不仅可用于配伍机制研究,还可用于不同相态中毒性和活性成分的分析,尽可能除去毒性较大的相态,保留毒性成分少、活性成分多的相态部分,使临床用药更加安全、有效。超分子化学从新的视角揭示了中药配伍后的物质基础,深入研究了中药配伍的合理性,使中药复方焕发新的活力。

2 基于“体内过程”的中药配伍研究

中药配伍产生药效或毒效的作用,不仅源于本身复杂的化学成分和组方配伍后各成分相互作用发生的量或质变化,成分进入机体后在吸收、分布、代谢和排泄(ADME)不同环节中的表现同样会影响配伍疗效,因此,研究不同药物成分在体内ADME过程有助于阐明配伍减毒增效的具体机制[26]。近年来,药物配伍后对成分ADME影响的研究方法主要有Caco-2细胞法[27]、外翻肠囊法[28]、单向肠灌流法[28]、血清药物化学[29]、药物代谢酶[30]以及药动学[31]等,各方法比较见表1。

2.1 基于体内过程的中药配伍增效机制研究

中药配伍后对吸收过程的影响主要表现在减少有效成分的外排以促进其吸收,增加药效成分生物利用度,发挥协同增效作用。P-糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白2(MRP2)在药物的吸收中起着重要的作用,能够将细胞内的药物外排,影响其生物利用度[40]。研究表明许多中药活性成分是P-gp和MRP2的底物,受二者的外排影响生物利用度较低,而配伍的中药能够作为二者的抑制剂,增加药效成分的吸收。

葛根和天麻是治疗心脑血管疾病的传统配伍,药动学实验发现与单一给药相比,二者配伍后能增加大鼠体内6种葛根活性成分的血药浓度,进一步单向肠灌流法研究表明天麻可以通过抑制P-gp和MRP2介导的葛根中药效成分外排,促进其吸收从而发挥配伍增效的作用[41]。黄芩苷是黄芩的主要活性成分,与多种配伍相比,葛根芩连汤全方中黄芩苷的吸收效果最好[42],采用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法和Caco-2细胞模型进一步发现黄芩苷是MRP2蛋白的底物,而葛根素能够抑制MRP2介导黄芩苷外排,促进黄芩苷的吸收,揭示葛根芩连汤配伍增效机制与增加主要药效成分的生物利用度相关[43]。

增加目标治疗部位的药物分布也是中药配伍后通过体内过程增效的机制之一。柴胡-黄芩是治疗呼吸系统和消化系统疾病的经典药对,其靶器官包括肝和肺,配伍后醋柴胡中多种皂苷成分与黄芩主要药效成分黄芩苷在肝、肺、脾组织中分布浓度显著正相关,并发现乙酰化皂苷、生柴胡皂苷可能是二者配伍后协同增效治疗肝、肺疾病的活性成分[44]。

此外,中药配伍还可抑制药物代谢酶的活性以减慢有效成分的代谢,达到增效作用。如白头翁皂苷BII显著增强川陈皮素在肝微粒体中的代谢稳定性,减慢其体内代谢速率,这与白头翁皂苷BII对细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)3A4酶的抑制作用相关[45]。综上,中药配伍后增效机制主要与增加药效成分生物利用度、改善靶器官药物分布及抑制相关酶对活性成分的代谢速率等体内过程密切相关。

2.2 基于体内过程的中药配伍减毒机制研究

有毒中药经过配伍后,可以通过抑制毒性成分的吸收、减少其在毒性靶器官中分布、促进其代谢和排泄等单一或多个过程发挥减毒的作用。雷公藤为治疗风湿顽痹之要药,但因其毒性较大,在临床上使用受限[46]。三七和生地黄分别与其配伍后,明显降低大鼠血浆中毒性成分雷公藤甲素和雷公藤内酯甲的曲线下面积AUC0-∞和最大血药浓度(Cmax),同时表观分布容积(Vd)/生物利用度(F)增加、达峰时间(tmax)延长,说明配伍降低了二者的吸收。

进一步采用在体肠灌流模型比较雷公藤单给药和配伍给药后的肠吸收特征,发现毒性成分在配伍组的肠壁吸收有效渗透系数、10 cm%肠吸收百分率和肠吸收速率常数都显著降低[47],揭示雷公藤通过配伍减少毒性成分吸收发挥减毒作用。而诱导多种器官毒性的雷公藤甲素联合甘草给药后,其在心、脾、肺等组织分布浓度降低且较为平缓,揭示甘草配伍对雷公藤甲素的减毒作用与影响药物分布过程相关[48]。

CYP450酶系是人体中最重要的药物代谢酶,参与大多数药物的代谢过程[49],中药配伍后可以通过影响CYP450同工酶,促进毒性成分的代谢以减轻毒性损伤。近年来,许多学者采用“Cocktail”探针药物法研究附子配伍减毒的机制,发现甘草、芍药、干地黄分别与附子配伍后,均可诱导CYP450同工酶的活性并增加其含量,从而加快乌头类生物碱的代谢以达到配伍减毒的作用[50-52]。Tai等[53]比较对照组、甘草甜素组与甘草甜素+CYP3A抑制剂酮康唑组的大鼠po雷公藤甲素后体内药动学特征,发现与对照组相比,甘草甜素组的AUC0-∞、平均驻留时间(MRT)和半衰期(t1/2)值显著降低,但这种下降的趋势被酮康唑显著逆转,表明甘草甜素通过诱导CYP3A的活性加速雷公藤甲素从体内代谢消除。

排泄过程的影响也是中药配伍减毒的机制之一,中药配伍可以加速有毒成分的排泄,防止其在体内蓄积造成损伤。张锐等[54]采用LC-MS/MS法研究雷公藤内酯酮配伍甘草前后的药动学参数、组织分布与排泄情况,发现配伍后雷公藤内酯酮的代谢速度加快且组织分布浓度降低,此外,联合给药组中雷公藤内酯酮的排泄总量约为单独给药组的2倍,表明甘草对雷公藤内酯酮药动学及组织分布与排泄均有显著影响。由此可见,配伍减毒的作用机制包括减少毒性成分的生物利用度、降低毒靶器官的药物分布、促进CYP450酶代谢药物、加速排泄减少蓄积等,涉及ADME各个过程。

3 基于“直接靶标”的中药配伍研究

目前关于中药配伍机制的研究多集中于主要成分引起的机体表观信号蛋白的表达,而这些表观蛋白是否为药物直接靶标尚不明确,严重限制配伍机制研究的深度。直接靶标是中药活性成分发挥药效的启动点,阐明中药活性成分的直接作用靶标是突破中药现代化研究中分子靶点机制不明的关键,也是当下研究的热点[55]。近年来,新的药物靶标发现技术不断涌现,将其应用于配伍中药成分直接作用靶标的研究,有助于从分子机制的角度解释配伍的合理性。

3.1 中药活性成分直接靶标发现技术

根据是否对活性成分进行修饰,可将中药活性成分直接靶标发现技术分为化学修饰法与非化学修饰法2大类。化学修饰法是指利用化学方法对中药活性成分进行结构改造,使之成为具有标记作用的衍生物或探针,与靶标蛋白稳定结合后,对靶标蛋白进行富集与鉴定,如活性蛋白质组分析(ABPP)[56-57],点击化学-ABPP(CC-ABPP)方法[58-60]等。非化学修饰法不需要对活性成分进行结构修饰,主要通过检测与成分结合后靶标的酶水解稳定性、热稳定性等理化性质变化,或通过计算机模拟成分与靶标的结合情况,来识别中药活性成分的直接靶标。应用比较广泛的有药物亲和反应的靶点稳定性分析技术[61-64]、细胞热位移分析技术[65]、表面等离子共振技术[66-67]及分子对接方法[68]等。

3.2 基于活性成分直接靶标的中药配伍机制研究

疾病的发病机制往往涉及某些关键蛋白的功能异常,而配伍中的不同药物可以通过直接作用于与疾病进展密切相关的不同靶标发挥协同增效作用。Ye等[69]研究透解祛瘟颗粒抗新型冠状病毒肺炎的疗效机制,应用表面等离子共振技术发现严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型Spike蛋白为槲皮素和异槲皮苷的结合靶标,而黄芪甲苷和芦丁能够与血管紧张素转化酶2蛋白结合,芦丁、异槲皮苷、槲皮素为方中主药连翘的药效成分[70],而黄芪甲苷为黄芪的主要成分[71],表明连翘佐以黄芪等药物配伍后通过不同的直接靶点调控病毒感染、免疫和炎症相关的疗效作用。

此外,药物配伍后可能通过竞争同一靶标,影响体内药效及毒性成分的作用,发挥减毒增效的作用。He等[72]利用分子对接技术发现外排转运蛋白P-gp为甘草中活性成分的直接结合靶标,乌头-甘草配伍后,其竞争性抑制乌头碱与P-gp结合,延长主要抗炎活性成分乌头碱在体内循环中的保留时间,从直接靶标的角度阐明了二者配伍后抗炎疗效强于乌头碱与甘草酸单用的机制。

近年来,曾克武等[73]提出“中药化学生物学”概念,在中医药理论指导下,通过寻找中药及其复方活性成分作用靶点并结合细胞表型、遗传学手段、多组学技术等研究方法,揭示成分直接靶标下游信号通路及其生物学功能,并利用细胞或动物模型验证,阐明中药药效物质直接靶标和分子机制,促进中医药理论创新与发展,表明直接靶标及其生物学功能在中药药效机制研究中的重要性。然而直接靶标发现技术虽已被广泛应用于中药的靶标发现,但在中药配伍研究中的应用较少。将各类靶标发现技术结合多学科技术应用于中药配伍后直接靶标的研究,可作为揭示中药配伍减毒增效机制的新方向。

4 中药配伍减毒增效的药理机制研究

中药配伍的最终目标是通过中药间的拮抗或协同作用实现中药有效性和安全性的最大化,药效作用是体现中药配伍优化合理性的核心,也是判断中药配伍合理性的金标准。因此,阐明药效药理机制是中药配伍研究的最终目的。目前中药配伍后药理机制的研究已从整体动物到器官组织、再到细胞亚细胞及分子生物学等多层次进行药效学指标评价[74]。

4.1 基于一般药效指标的中药配伍药理机制研究

中药配伍后产生减毒增效的药理作用,一般通过观察给药后动物的行为学和死亡情况、脏器指数、组织器官生理或病理形态、药效或毒性生化指标等常见的药效指标来进行评价。

中药配伍的减毒作用通常是成分间有拮抗作用,通过逆转毒性成分产生的异常指标以增强对机体系统的保护作用。如雷公藤甲素可诱导氧化应激反应,引起线粒体损伤,导致细胞凋亡或自噬,从而对肝、肾、睾丸和心脏等多个靶器官产生毒性,使其临床应用受到极大限制[75]。严银银等[76]通过实验证实了藏红花素可以逆转雷公藤甲素造成的异常指标,通过配伍可减轻对心脏、肝等器官的损伤,藏红花素对雷公藤甲素的减毒机制可能与抗氧化应激作用有关。此外,白芍和金钱草也可通过抗氧化应激作用减轻雷公藤所致的肝损伤或肾损伤[77-78]。

中药配伍的增效作用通常是成分间有协同作用,共同发挥对机体系统的保护作用。葛根素和天麻素均有改善微循环的作用[79-80],姜丽等[81]发现二药配伍后,其抗凝血和抗血小板聚集作用均强于二药单用。制川乌和白芍配伍也具有协同增效作用,可以增强抗炎效果,其增效机制可能与调节血浆中前列腺素E2和血清中一氧化氮的含量有关[82]。此外,协同增效作用也可表现在不同指标的互补上,如丹参和红花配伍在炎症和氧化等指标表现出互补作用,表明二药配伍在抑制炎症和抗氧化方面均具有较好疗效[83]。

4.2 基于“成分-靶点-疾病”网络的中药配伍药理机制研究

中药及其配伍中多成分与机体内多靶点的相互作用是目前中医药研究的热点及难点,而网络药理学构建“成分-靶点-疾病”等分子网络的研究策略,突破了传统“一药一靶”研究模式[84]。以网络拓扑分析为基础,通过将配伍中的药效成分与疾病相关靶点进行关联分析,找出生物分子网络中的关键节点和通路,综合性地观察各成分对疾病的干预和影响,从而整体地研究中药配伍复杂的药理机制。

Xie等[85]采用网络药理学和实验验证研究乌头汤治疗类风湿关节炎的主要途径以及方中5种中药如何协同作用的药理机制。从TCMID和GeneCards数据库获取成分及其靶标与疾病靶标,构建成分-靶点网络并预测乌头汤抗类风湿关节炎的关键途径为核因子-κB(NF-κB)和核因子E2相关因子2(Nrf2)通路,分子生物学实验验证乌头通过抑制NF-κB通路介导的炎症反应和促进Nrf2通路介导的抗氧化作用缓解类风湿性关节炎症状,而方中麻黄抑制NF-κB通路和促进Nrf2通路、黄芪则通过促进Nrf2途径增强乌头的疗效。Li等[86]通过网络药理学研究葛根芩连汤中的主要成分及其调控的疾病相关靶标和信号通路,结合进一步实验验证方中葛根素和甘草次酸通过上调糖原合酶激酶3β和下调CTNNB1基因影响Wnt通路发挥协同抗癌作用。

综上所述,药物经过配伍,不同的药效成分进入体内作用于与疾病相关的靶标蛋白,并通过生物分子网络中关键蛋白的作用,影响下游信号通路起到减毒增效的作用,配伍后不同药物的活性成分可能通过影响同一信号通路增强疗效,或影响能发挥协同作用的多个信号通路增强疗效。

4.3 基于机体差异代谢物的中药配伍药理机制研究

代谢物及其网络为进一步反映机体状态的直观指标,中药方剂配伍的疗效必然涉及对紊乱失调代谢网络的调控[87],探究配伍方剂干预后的代谢网络调控机制,有助于揭示相应药物的效应机制,进一步阐释中药复方的配伍规律。目前研究代谢物及其网络变化的有效手段是代谢组学,是继蛋白组学之后一个系统生物学的新分支,常利用核磁共振波谱或质谱等分析技术,对正常状态、病理状态、单用药及配伍给药的动物体液样品进行检测以鉴定差异代谢物,并通过数据库进行整合分析得到相关代谢簇及代谢途径信息,从机体代谢网络变化的角度揭示配伍药理机制[88]。

配伍后不同药物的活性成分可能通过影响同一代谢通路或更多代谢通路,起到协同增强疗效的目的。张越凡等[89]通过超高压液相色谱飞行时间质谱串联技术、主成分分析和正交偏最小二乘方判别分析发现三七-丹参配伍可通过调控亚油酸代谢、类固醇激素生物合成、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢等8条与炎症及氨基酸代谢相关的代谢通路治疗外伤血瘀证,而单用三七或丹参仅能调控部分代谢通路。同样,配伍的药物能反向调节毒性成分相关的代谢通路,达到配伍减毒的作用。Dong等[90]结合超高压液相色谱飞行时间高分辨质谱技术及模式识别方法系统地分析川乌毒性机制,鉴定出17个与川乌毒性相关的潜在标志物,并发现配伍干姜、白芍和甘草均能不同程度调控川乌紊乱的戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢途径。

肠道菌群是生物体肠道中寄生的微生物统称,广泛参与机体内短链脂肪酸、胆汁酸、三甲胺及氨基酸等多种物质的代谢调节,其微生物结构失衡常导致机体内代谢出现紊乱[91]。维持肠道菌群正常对机体健康具有重要意义,研究表明中药配伍后可以通过调节肠道微生物的种群结构、功能、代谢等方面,调控机体的生理或病理状态。栀子药用历史悠久,药理作用广泛,但其具有肝毒性,过量使用、配伍和炮制不当易引起肝损伤[92]。

罗羽莎[93]研究表明栀子在伪无菌大鼠中造成的肝损伤小于正常大鼠,且通过配伍淡豆豉可减轻栀子所致损伤,进一步通过16S rRNA高通量测序及气相色谱质谱联用发现,栀子可使大鼠肠道有益菌丰度减少,致病菌丰度增大,并降低了肠道中代谢物短链脂肪酸的含量,而配伍淡豆豉可逆转以上异常,揭示二者通过影响肠道菌群及其代谢产物发挥配伍减毒作用的机制。陈源等[94]研究发现以黄连为主,大黄为辅进行合理配伍后给药,能够改善2型糖尿病大鼠体内的糖脂代谢紊乱及菌群结构失衡,进一步Spearman相关分析发现差异菌属的变化与代谢指标的改善存在相关性,揭示黄连-大黄配伍通过调控肠道菌群改善糖脂代谢紊乱的作用机制。

5 结语与展望

随着配伍后中药的体外成分、体内过程及直接靶标研究的深入,愈加证实中药配伍后物质基础与分子机制的复杂性,而通过动物或细胞模型的药效学实验、代谢组学技术以及网络药理学方法研究中药配伍后的药理机制,虽然取得一定的进展,但仍然存在不足:动物或细胞模型的药效学实验及代谢组学技术多以中药提取物进行实验,难以阐明其物质基础;网络药理学研究中,配伍中药的成分及其作用靶点来源于数据库,目前数据库收录的成分完善度尚有不足,且忽略了配伍后成分含量及其ADME的影响。

近年来不断有新技术、新策略提出,将多学科技术融合应用于中药配伍药理机制的研究能更全面诠释配伍的合理性。因此,本文提出以“体外成分、体内过程、直接靶标”研究为基础,“中药配伍药理机制研究”为目的,探索中药配伍减毒增效作用机制的现代研究模式(图1)。通过中药配伍后体外成分及体内ADME过程的研究,明确药效学实验及代谢组学研究中的物质基础,并对网络药理学成分数据库进行补充;配伍后直接靶标的研究与分子生物学技术结合,将药理机制研究由一般药效学指标深入到分子机制指标,亦能为网络药理学数据库进行补充;网络药理学与代谢组学联合分析,研究差异代谢物与基因、蛋白的关系,从信号通路与代谢途径的不同层次相互印证,深入揭示中药配伍的药理机制。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献(略)

来 源:郑雁雪,王圆圆,王 琳,王玉明,魏金霞,李遇伯.中药配伍减毒增效的现代研究及思考 [J]. 中草药, 2023, 54(2):386-395.

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