济南二甲基亚砜(细胞冻存与二甲基亚砜)
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济南二甲基亚砜(细胞冻存与二甲基亚砜)
利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存(细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,),可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%-15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。
想一下,菌种保存常用的两种方法?1.固体斜面培养基临时保藏 2.甘油管藏(-20℃)
步骤
(一)细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;
2. 取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。
3. 去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;
4. 离心1000rpm,5min;
5. 去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
6. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;
7. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
8. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
(二) 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
3. 离心, 1000rpm,5min;
4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;
5. 次日更换一次培养液,继续培养。
注意事项
1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;
2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;
3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。
二甲基亚砜
一种含硫有机化合物,分子式为(CH3)2SO,常温下为无色无臭液体,可燃,带有苦味。凝固点18.4℃,沸点189℃,与水混溶的特性,能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物,被誉为“万能溶剂”。
细胞冻存中的应用
在细胞冻存中的应用二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中,为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤,要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中,降低冰点、延缓冻存过程,同时提高细胞内离子浓度,减少细胞内冰晶的形成,从而减少细胞损伤。超低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快,尽快洗掉二甲基亚砜,否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜(DMSO)是最好的细胞冻存保护剂,
它是一种渗透性保护剂,对细胞毒性小,分子量小,溶解度好,能迅速透入细胞,降低冰点,提高细胞膜对水的通透性,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外,在胞外形成冰晶,提高细胞内的电解质浓度,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞冻伤。
纯二甲基亚砜的冰点是18.45℃,含水40%的二甲基亚砜-60℃不冻,
在医疗中的应用
DMSO对许多药物具有溶液性、渗透性、本身具有消炎、止痛,促进血液循环和伤口愈合,并有利尿、销静作用。能增加药物吸收和提高疗效,因此在国外叫做“万能药”。各种药物溶解在DMSO中,不用口服和注射,涂在皮肤上就能渗入体内,开辟了给药新途径。
1.抗炎
发炎是组织对直接外伤(筋肉扭伤、刀伤、灼伤、震动、辐射等)或间接伤害(如感染)的反应。发炎涉及到疼痛、发热、泛红、肿胀和丧失功能。这是机体包围受伤部位的特殊方式,以便机体修护患处。DMSO能够减低发炎的严重度。
DMSO可以改善全身的血液循环。它似乎可以扩张大血管,收缩毛细血管床。这有助于减少患部的肿胀和体液渗出,同时增加身体排除患部毒素和废物的能力。DMSO可以使需要几周才能复原的伤势,缩减为几天。
2.抗菌
DMSO并不是高效的全能消毒剂,但它有中度的抗菌效果。35%的DMSO溶液可抑制广泛的细菌和真菌(fungi)生长。它也会使某些病菌对抗生素更加敏感。曾经有一项研究显示,5%的DMSO溶液可以使肺结核杆菌对「链霉素」(streptomycin,肺结核药)的敏感性增加200倍。
3.利尿
从皮肤着手,DMSO只有轻微的利尿效果;但适当的注射,就可以成为最强的利尿剂之一。在某些案例中,它增加了尿量10倍。DMSO对水的强亲和力把过量的液体摄入到血液里,然后经由肾脏过滤排出。严重的头部和脊髓受伤会引起脑水肿和脑细胞肿胀,造成颅内压力增加和永久性神经受损;DMSO作为脱水剂、利尿剂可能就是这类患者的救星。
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