活体成像仪为什么看不到荧光(荧光素酶灵敏度太低怎么办？汉恒新型荧光素酶新升级)

Posted 2023-05-31

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活体成像仪为什么看不到荧光(荧光素酶灵敏度太低怎么办？汉恒新型荧光素酶新升级)

报告蛋白是量化基因或者信号通路活性必可少的工具，其中荧光素酶(Luciferase)因其灵敏度高、检测方便，发光速度快等优点，已成为倍受欢迎报告蛋白。其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Fireﬂy)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。

荧光素酶可以催化底物（luciferin）发出生物荧光(bioluminescence)，通过荧光测定仪设备可对luciferin氧化过程中释放的生物荧光进行检测，常应用于双荧光素的实验、信号通路活性的报告基因、分子间的互作动物活体成像示踪等等。

但是Fluc荧光强度较弱，灵敏度低，对实验结果影响较大。对此，汉恒生物在Fluc基础上研发了新型的荧光素酶NLuc，经过优化的Nluc与普通的Fluc相比，发光强度更高，反应速度更快，自发光的背景更低，灵敏度更高。

NLuc在荧光素酶相关的实验中的效果。

1. NLuc可以替代FLuc提高双荧光素酶实验的灵敏度

双荧光素酶报告基因经常用于miRNA与mRNA/lncRNA/circRNA的互作和启动子活性的研究。在启动子活性检验的研究中，将要研究的启动子序列构建到报告载体中作为萤光素酶的启动子，通过检测与地物反应释放的荧光信号强弱来反映启动子的活力。如果荧光信号本身较弱，就可能使一些弱启动子序列被判定为阴性，相反，如果荧光信号较强，那么实验就可以在更大的区间内量化检测结果的强弱。

以质粒为载体，分别转染了Nluc的过表达质粒，FLuc的PGL3质粒（pLuc，常见的Fluc的报告质粒）以及Nluc的对照质粒CLuc（与Nluc相同的过表达质粒，但编码的是传统Fluc）。通过对比荧光强度发现，NLuc产生的信号要远高于FLuc和CLuc（图1）。

图1 过表达质粒对比不同荧光素酶的荧光强度

2.NLuc构建的稳转株具有更强的荧光信号

构建荧光素酶过表达稳定株是构建报告基因的工具细胞或者肿瘤接种示踪等试验必不可少的环节，在这类实验中荧光信号越强，背景越弱，越有利于实验的进行。使用慢病毒感染293T细胞（MOI 10）进行建系。20000 cell/well铺板到96孔板中，每组6孔，培养48h后进行检测，CLuc与PLuc信号值无差异，而Nluc是这两组的两倍左右，结果与质粒瞬转一致（图2）。

图2 293T-Luc稳转细胞株荧光强度的对比

3.Nluc活体成像效果优于其他荧光素酶

活体成像技术主要采用生物发光直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为的技术，比如可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、示踪AAV感染效果等等，荧光需要透过皮肤和肌肉才能被仪器检测到，因此荧光素酶的发光强度越强越好，减少背景光对实验的干扰。

使用活体成像仪观察293T-luc稳转系（luciferin浓度150ug/ml），CLuc略好于PLuc，NLuc信号明显强于另外两组（图3）。

图3 细胞实验活体成像结果对比

使用AAV-Luc的质粒转染细胞NLuc的信号强度约为CLuc的3-4倍（图4）。使用AAV2/8-Luc和AAV2/9-Luc感染293T后检测luc信号，AAV-NLuc分别是CLuc的2.5和5倍（5图）。

图4 AAV-luc质粒瞬转信号对比

图5 AAV-luc病毒感染293T信号对比