横切机同步轮(基金项目：单倍体育种技术的应用进展)

Posted 2023-05-30

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横切机同步轮(基金项目：单倍体育种技术的应用进展)

基金项目：单倍体育种技术的应用进展

基金项目：农业农村部计财司开放式课题“特色热带作物种质资源精准鉴定与新品种培育”子课题“百香果种质资源精准鉴定与新品种培育”(No.RZJP2020008)。

冯红玉等

0 引言

高等植物的生命周期以孢子体和配子体世代交替为特征，当二倍体细胞减数分裂形成雄性和雌性配子时，出现配子体阶段，这一阶段的细胞染色体数目为孢子体数目的一半。单倍体是只含有配子染色体数目的植物的广义术语。将仅有母体一半染色体的植物器官、组织或细胞通过诱导或离体培养的方式产生单倍体，再利用各种染色体加倍技术将单倍体加倍形成拥有母体染色体组数目植株的这种育种方式即为单倍体育种。自1922年Buchholz和Blakeslee 在曼陀罗花中发现第一个天然单倍体胚以来，单倍体一直是植物生理学家、胚胎学专家、遗传学家和育种学家们的研究热点。而Guha和Maheshwari在1964年和1966年通过曼陀罗花药离体培养获得大量单倍体植株的开创性科研成果更是为高等植物单倍体育种开辟了新的道路。国内的研究机构继中国科学院遗传研究所(1972年)第一次用水稻(Oryza sativa)和小麦(Triticumaestivum)花粉成功培育出水稻和小麦的单倍体植株后亦纷纷对单倍体育种开展了广泛的研究，为中国单倍体育种事业的发展奠定了理论基础，同时也为新品种的繁育做出巨大的贡献。目前，单倍体育种普遍应用于禾谷、草本、林木、果树等作物的育种研究中，然而在典型热带果树单育种研究中的应用则相对较少。西番莲(Passiflora spp.)是兼具花型美观、花色丰富、气味芬芳、果实美味、营养丰富等优点于一身的热带藤本果树，目前国内外对西番莲果汁的需求日益增长，西番莲种业有着非常好的发展前景。虽然西番莲以叶、芽、根、胚乳等为外植体的组织培养技术均已发展较成熟，但是单倍体育种在西番莲中的应用却未见报道，作者在接下来的科研工作中将重点对西番莲的单倍体育种展开研究，以期填补单倍体育种技术在西番莲育种中的应用空白。本文结合现有研究报道，对人工诱导孤雄生殖、人工诱导孤雌生殖、染色体加倍等单倍体育种培养技术的发展现状进行综述，并对单倍体育种技术在禾本科作物、花卉、林木和果树育种方面的应用进展进行总结，同时，对其在其他领域的应用进行了展望，为今后西番莲单倍体育种研究提供理论指导。

1 单倍体产生途径

1.1 自然发生的单倍体

自然界中的天然单倍体植株往往由于花器官受到外界刺激或发育异常引发孤雌生殖或孤雄生殖的现象，从而形成单倍体植株。对绝大多数植物来说，单倍体植株的产生均属于发生概率非常低的偶发性事件，无法满足生产的需要。

1.2 人工诱导单倍体

人工诱导单倍体是指人类利用各种技术手段，通过诱变、离体培养等方式产生的单倍体。其中离体培养法是指将植物体中的花药、花粉或未授粉的子房、胚珠等组织或细胞从母体中分离，在体外通过人为创造的环境加入相应的诱导激素培养形成单倍体的方法。离体培养法是当下可以在短时间内获得大量单倍体的高效实用的人工诱导单倍体的方法。最常用的离体培养技术有体外孤雄生殖技术和体外孤雌生殖技术。

2 单倍体育种培养技术

2.1 人工诱导孤雄生殖技术

离体花药或花粉等雄性组织在含有各种物理和化学刺激下的无菌环境中培养形成单倍体的技术称为人工诱导孤雄生殖技术。孤雄生殖单倍体体外培养的方法主要有花药培养和花粉（小孢子）培养。

2.1.1 花药培养花药培养是采用植物雄性生殖器官进行单倍体培养的方式。由于花药里含有大量的单倍体小孢子，因此采用花药培养的方式获得单倍体是非常高效的，加上其培养过程相对简单，从而成为被广泛使用的单倍体育种方法。据报道，已经有茄科中的辣椒(Capsicum annuum) 和烟草(Nicotiana tabacum) 、禾本科中的大麦(Hordeum vulgare) 和小麦、胡椒科中的胡椒(Piper Nigrum) 等250多个物种成功通过培养花药产生单倍体。

在进行花药培养之前，首先，要创造无菌的培养环境作为前提条件；其次，要制备能诱导离体花药分化形成愈伤组织的培养基，其中不同浓度的生长素和细胞分裂素对绝大多数物种花粉的离体培养来说，都是必不可少的。在花药的选取方面，一般用小孢子处于单核早期至晚期的花药。花药在培养基培养的过程中，还需要经过连续的冷热交替和光暗交替处理。待形成愈伤组织后则需移植于条件适宜的增殖培养基中。

2.1.2 花粉（小孢子）培养花粉培养是直接取用雄性生殖细胞进行单倍体培养的方式。使用花药培养单倍体的最大优点是操作简单和成功率高，然而花药壁等外部组织的存在对花药培养单倍体产生一定的干扰。通过离体培养花粉的方式虽然相较于花药培养难度较大，但可以直接克服花药壁等组织细胞的负面影响，保证育成后的单倍体来源的纯正性。此外，花药培养还可以收集到大量不同时期的同步胚，这使小孢子培养成为研究胚胎发生的良好实验材料。虽然与花药培养相比花粉培养出现较晚，操作难度较大，但是，自1970 年首次在甘蓝 (Brassica oleracea) 和油菜(Brassica napus)花粉培养中成功形成愈伤组织之后，在许多作物中也相继地通过离体诱导技术成功利用花粉培育出了单倍体植株，例如在烟草、油菜(Brassicanapus)、胡椒、小麦、大麦、水稻等作物中，花粉的单倍体培养均被成功应用且已开发出高效实用的生产方法。花粉培养所需无菌条件以及基础培养基的制备方法与花药培养相似，但在特殊营养需求方面要比花药培养要求更加复杂和严苛。

2.2 人工诱导孤雌生殖技术

与人工诱导孤雄生殖技术相对的是人工诱导孤雌生殖技术，即离体子房、胚珠等雌性组织在含有各种物理和化学刺激下的无菌环境中培养形成单倍体的技术。人工诱导孤雌生殖技术常用的培养材料是未受精的子房和胚珠。由于孤雌生殖技术相对孤雄生殖技术操作繁琐、技术难度高且成功率低，是目前最不易掌握和使用率最低的单倍体培养技术，但是，有些物种在无法通过其他培养方法获得所期望的结果时，离体孤雌生殖方法则是必要而有效的。由于不同的作物有其不同的生物学特性，所适用的单倍体生产方法自然会不一样，因此每一种培养技术都有其存在的必要性，均值得人们进行广泛的学习和研究。

2.2.1 子房培养子房培养是用未受精的子房作为外植体进行单倍体离体培养的方式。目前，三叶橡胶树(Hevea brasiliensis) 、刺槐(Robinia pseudoacacia) 等已成功通过子房培养的方式获得单倍体植株。子房培养过程中，往往需要用到子房切片技术，即将未授粉的子房或未成熟的花蕾横切成薄片，再将薄片放于无菌培养基中培养，然后经过连续的冷热交替及光暗交替等处理。

2.2.2 胚珠培养胚珠培养是直接取未受精的胚珠作为外植体进行单倍体离体培养的方式。这种方法已经成功应用于烟草、洋葱 (Allium cepa)、甜菜 (Betavulgaris)等作物的单倍体培育中。胚珠培养同样需要有无菌的环境条件、适合的培养基以及有效的应激处理。胚珠培养至关重要的一步是胚珠的切取过程，不同物种胚珠的大小不一样，胚珠切取的难易度也不同，相对于大种子物种而言，小种子物种的胚珠切取必须借助显微技术，取材难度较高。

2.2.3 辐照花粉诱导孤雌生殖技术辐照花粉诱导孤雌生殖技术是用射线辐照植物花粉，使花粉萌芽但不受精，从而刺激胚胎发育，再将胚胎进行离体培养获得单倍体的孤雌生殖方式。自从Sauton和Dumas du Vaulx(1987)第一次成功使用这种技术培育出单倍体后，该技术即越来越广泛的应用于植物单倍体育种之中，且其在果树单倍体育种中的应用，往往能在一定程度上解决果树单倍体育种相对困难的问题。辐照花粉诱导孤雌生殖过程中，钴-60(60 Co)γ射线和X-射线是可用作辐射的两种射线，其中常用的是钴-60(60 Co)γ射线，X-射线则较少用到。此外，射线辐照花粉的时间和强度是影响孤雌生殖成功率的重要因素之一。

2.3 染色体加倍技术

单倍体育种过程中往往通过采用秋水仙素诱导等方法人工二倍化单倍体形成具有正常染色体组数的植株，从而最终应用到生产实践中。此外，还需采用形态学鉴定、细胞学特征鉴定、生化标记、分子标记等技术进行倍性鉴定。

3 单倍体育种在不同植物上的应用

3.1 单倍体育种在禾谷类作物中的应用

禾谷类作物是中国乃至世界最重要的粮食作物，对此类作物的育种改良是各个国家都高度重视的。而单倍体育种是有效推进禾谷类作物优良品种培育进程的有效手段。体外培养单倍体育种在水稻、小麦、大麦、玉米(Zea mays)等禾谷类作物中发展较成熟，且水稻和小麦的一些改良品种已得到推广生产。在小麦中，用花粉单倍体育种代替常规杂交育种，可缩短育种周期3~4代。同时，禾谷类作物的单倍体培养也可以通过选择性消除种间授粉后的特定染色体的方式诱导形成，这种方式目前最常应用于小麦和玉米等作物中。此外，通过体外孤雌生殖技术结合杂交和胚胎拯救培养技术，可以增加小麦孤雌生殖的效率。单倍体育种技术在玉米作物中的应用起始于1952年。相较于繁琐冗长的系谱法、回交法等常规的育种方法，利用体外孤雌生殖或孤雄生殖等单倍体育种技术可在短短的3季内获得纯合自交系，有效的缩短了玉米的育种周期。可见单倍体育种技术在禾谷类作物育种中具有极高的利用价值。

3.2 单倍体育种在草本花卉育种中的应用

经过长期的引种、驯化和培育过程，中国现有栽培花卉品种众多，加上得天独厚且种类繁多的天然花卉种质资源的存在，使中国成为令世界瞩目的花卉资源宝库。如何充分利用现有资源，培育出品系更纯、性状更优、市场价值更高的优势品种，是值得我们去思考的问题。单倍体育种技术拥有传统育种技术所没有的优势，充分利用其优势可以突破花卉育种中存在的一些技术壁垒。

在现有花卉品种中，草本花卉占据着重要的地位。自从单倍体技术问世以来，中国的科研人员成功培育出的花卉单倍体品种数量位列世界前茅。在花卉单倍体育种中，单倍体育种技术在草花育种方面的应用发展较快。目前萱花(Hemerocallis citrina)、百合(Lilium brownii)、兰花 (Cymbidium)、金鱼草(Antirrhinum)等草本花卉在单倍体育种方面均取得了较大的成功，且往往使用花粉、花药、子房或胚珠等离体孤雄或孤雌培养技术便能满足需求。国内的大量研究报告也证实了这一观点，例如，王延玲等通过低温预处理增加了仙客来(Cyclamen persicum)花药培养的单倍体的获得率；王史琴通过花粉培养快速获得了小报春(Primula orbesii)新品种红星和重瓣类的单倍体；袁素霞选用7个百合基因型的未授粉子房进行离体诱导形成的胚胎中异于母体倍性的胚胎占比率高达 69.35% 。王丽花等对 12 个非洲菊 (Gerberajamesonii)品种的未授粉胚珠进行离体培养，结果都能形成愈伤组织或不定芽，且经过倍性分析显示有单倍体的存在；黄丽娟等用花药和子房均成功培育出了Sweet Dream、雨林花烛、红衣天使等红掌(Anthuriumandraeanum)品种的单倍体植株；此外，张乐民利用小孢子离体培养技术，仅一个世代便育成具备高纯度、高稳定性的马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)纯系品种。

3.3 单倍体育种在林木育种中的应用

林业中的林木种类基本属于木本植物，他们在育种方面往往面临着世代交替缓慢、自交亲和性低，育种周期长，常规育种方式获取纯系品种困难等困境，而利用拥有基因纯合快、育种时间短、效率高等优点的单倍体育种技术进行木本植物育种，能有效的帮助其解决育种过程中所面临的困境。目前，单倍体植株或愈伤组织已培育成功或正在研发当中的林木树种有：茶树(Camellia sinensis)、杨树 (Populus)、刺槐、印楝(Azadirachta Indica)、合欢(Albizia julibrissin)等，但据Forster等报道，在已有的被报道的200多种单倍体和双倍单倍体物种中，木本植物种类所占的比例还不到10%。因此，对木本植物单倍体育种技术的研究既有广阔的空间又任重而道远。为此，在进行木本植物育种过程中，除了使用花药、花粉、未受精的子房和胚珠进行离体培养获得单倍体外，还应该更加积极的尝试别的单倍体育种方式或研发新的能满足更多木本植物单倍体育种需要的技术方法。

3.4 单倍体育种在果树育种中的应用

水果是广受人们喜爱的食物，其营养价值是其他食物所无法替代的。随着人们生活水平的提高，对水果品质要求也越来越高。如何更好的保持水果的优良品质或培育出品质更加优良的水果品种是果树育种专家们一直以来研究的重点之一。果树通常包含木本果树、藤本果树和草本果树在内，其中绝大部分果树种类为木本果树。

作为木本植物的木本果树，在品种选育过程中与林木面临着共同的困境，即难以通过传统方法获得纯性品种。而单倍体育种同样是解决木本果树纯性育种困难的有效方法。目前在木本果树单倍体育种研究中，通过花药培养成功获得单倍体的案例最多。而在大多数的研究报道中，主要建立在经验的基础上，把研究重点放在影响果树单倍体培育的外界因素及其性状表现上，而鲜少见到对果树树种内部作用机理的深入研究。以下一些研究成果均说明了这一观点。冬枣(Ziziphus jujuba)花药培养达到最大诱导率的条件为外植体摘取时间为花蕾呈现黄绿色或淡黄色时，低温预处理温度为4℃，甘露醇预处理夜浓度为0.4 mol/L，处理时间为3天，基本培养基为1/2 MS，碳源为30 g/L的麦芽糖。宁夏枣树花药最佳诱导培养基为MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 1.0 mg/L + IBA 0.4 mg/L；最佳分化培养基为 MS + 6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.6 mg/L +AgNO 3 0.5 mg/L 。 ‘大五星’枇杷(Eriobotrya japonica)花药离体培养最适条件为外植体处于单核期的3年生果树花药，4℃低温预处理2天；愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D 0.5 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L；胚状体诱导培养基 MS + ZT 0.05 mg/L + NAA 0.01 mg/L + IBA0.05 mg/L；蔗糖浓度30%，黑暗培养。柑橘(Citrusreticulata)早花品种花药培养再生率高于晚花品种；适宜的低温预处理时间为7~8天。

虽然藤本果树和草本果树种类较少，但单倍体育种已应用于他们中一些种类的育种研究中，例如藤本果树中的葡萄 (Vitis vinifera)、猕猴桃 (Actinidiachinensis)等和草本果树中的草莓(Fragaria ananassa)等，但也基本局限于采用花药培养的方式，且研究内容也仅针对于培养条件的对比研究中。例如，在王广富的研究中，诱导藤本果树软枣猕猴桃(Actinidiaarguta) ‘魁绿’和‘绿王’花药分化的最佳低温(4℃)预处理时间为5天，培养基中加入的最佳2,4-D浓度分别为1 mg/L和2 mg/L，6-BA、蔗糖和琼脂的最佳浓度均为5 mg/L、30 g/L、5.5 g/L；在赵永钦等 [54] 的研究中，草莓的花药培养结果为： ‘甜查理’和‘章姬’两个品种在保持花蕾表面湿润的状态下，4℃低温预处理3天有利于花药分化的诱导。

综合以上研究结果，影响果树花药培养获得单倍体植株的因素主要有：外植体的基因型和小孢子发育时期、预处理方式、培养基成分、培养条件等。其中多数果树花药培养的最佳时期为小孢子单核期，低温预处理温度为4℃，低温预处理时间因外植体基因型的不同而有所差异，基本培养基一般都选用MS培养基，培养过程中所需添加的植物生长调节物质往往包括2,4-D、6-BA、ZT、NAA、IBA 等，常用的糖源物质为蔗糖，此外有些果树花药培养过程中还需甘露醇等物质作为预处理液。

果树单倍体育种除了多数使用花药培养外，还有少数通过其他方式成功获得单倍体的案例。比如，何道一等通过辐射花粉诱导雌核发育技术成功获得‘红星’、 ‘富士’、 ‘辽伏’、 ‘贝拉’等苹果(Malus domestica)品种的单倍体植株。此外，王永清等采用给在开花前已剪去部分柱头的‘大五星’枇杷花所得的未成熟的小种子进行离体培养的方式所得的再生植株中，有2.4%为单倍体植株。在柑橘单倍体育种研究中，除了成功通过花药培养获得单倍体植株外，还成功诱导了游离小孢子的再分化；此外利用辐射花粉诱导柑橘雌核发育的方式培育出的单倍体结合细胞融合技术使其与二倍体杂交可培育成三倍体，这在果树新品种选育中具有广阔的应用前景。

4 应用前景

4.1 建立纯合系

通过单倍体育种的方式有利于作物品种改良纯合系的建立，这是快速选育出优质高产作物品种和保持作物品种杂种优势的有效手段。使用传统的近亲繁殖的方法，需要经过世代的连续繁殖，消耗很长的时间才能形成一个纯系品种。而且很多木本植物近交结实率非常低，或完全没有种子，因此，通过近交获得纯系的可能性是非常小的。而通过秋水仙素等方法处理，将离体培养的单倍体进行二倍体化，可以在一代内获得纯合二倍体植株，大大的缩短了纯合系建立的时间。

4.2 推进遗传学研究

单倍体植株作为配子样本，可以直接得到基因间的重组值，明确许多经济作物的一些重要遗传性状。在对雄配子体进行体外培养的过程，除了产生单倍体外，还有助于筛选出有新遗传变异的配子体。此外，利用单倍体植物也可以研究基因组内或基因组间的染色体同源性。因此，可以有效的促进遗传学的研究进展。

4.3 形成新的基因型

在育种研究中，新品种的获得往往通过新基因型的建立实现，而新基因常由基因突变形成。由于大多数突变是隐形的，在二倍体植株中不表达。而只有一组染色体的单倍体植株则可以同时显示显性和隐性特征，便于通过性状选择突变基因。此外，单倍体培养技术结合杂交技术使染色体加倍后，还能获得携带外源染色体的新基因型品种。

4.4 培育转基因品种

单倍体培养技术中的小孢子培养属于细胞水平上的离体培养方法，因此，可以利用显微注射技术，将目标基因转移至离体培养的小孢子细胞中，再利用其高度的再分化能力，使成功育成转基因植株成为可能。

4.5 加快热带果树的育种进程

典型的热带果树单倍体育种仅在荔枝(Litchichinensis) 、龙眼 (Dimocarpus longan)、番木瓜(Carica papaya)、火龙果(Hylocereus undatus) 、番荔枝(Annona squamosa) 等少数种类中有培育成功的案例且基本上仅局限于花药培养的方式，而西番莲、菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus)、榴莲(Durio zibethinus)、杨桃 (Averrhoa carambola)、红毛丹 (Nepheliumlappaceum)、莲雾 (Syzygium samarangense)、蛋黄果(Lucuma nervosa)等多数热带果树中均未见报道。故单倍体育种在热带果树中的发展空间巨大。因此，在热带果树单倍体育种过程中，除了使用一些常用的方法外，还可以尝试一些最新的单倍体诱导方法，如模拟有性生殖诱导植物单倍体，即利用CenH3 RNAi和抑制技术处理使小孢子染色体消失，产生空核假雄配子，从而诱导孤雌生殖产生单倍体。