植物组织培养主要应用于哪些方面(经典实操——植物组织培养操作技术)

Posted 2023-05-30

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植物组织培养主要应用于哪些方面(经典实操——植物组织培养操作技术)

植物组织培养快繁技术是生物技术领域中的一项新技术，也是高科技技术。以前大多停留在实验室阶段，如今部分企业已经实行产业化市场运作，直接服务于经济发展。植物组培又称为植物克隆，植物组织培养生产是一个系统工程，从一个外植体(芽、侧芽、叶片、茎段、花梗、花托、根段、根芽等)→启动培养产生中间繁殖体→中间繁殖培养→生根幼苗培养→试管苗驯化移栽→田间定植，这些环节都需要熟练的操作技术，才能保证生产计划的按时完成。操作技术主要包括熟练地配制培养基，具备娴熟的接种技术，掌握各种灭菌技术，以最大限度地减少污染的发生。操作人员应具备一定的化学知识，以对实验室基本设备进行日常管理及维护。

植物组织培养的两种过程

植物组培的优点有生长周期短，繁殖率高；培养条件可以人为控制；管理方便，有利于工厂化生产和自动化控制等。因此，植物组培在生产上得到了广泛应用，包括快速繁殖、培育无毒苗、选育新品种、人工种子等。植物组培技术繁殖植物不仅快速，而且可摆脱自然地理环境和季节的限制，对繁殖系数低和经济价值高的植物品种具有重要意义。

除此之外，植物体的维管束中有输导组织，在运输营养物质的同时，病毒也会通过输导组织感染植株的各个部位，因此无性繁殖的植物体内病毒浓度常逐代积累，危害生产。由于植物茎尖生长点具有非常强的分裂、分化能力，当植物刚分裂出的幼嫩细胞尚未分化出维管束时，通常不会存在病毒。因此取茎尖进行组织培养，可以得到脱毒苗。

植物组培技术也是人们培育筛选新品种的有力方法。通过花药培养获得单倍体植株，可大大缩短育种时间，提高育种效率。利用原生质体融合能够一定程度上克服远缘杂交不亲和性，从而获得体细胞杂种，培育优良品种。

植物组织培养操作技术

　　1 溶液配制技术

　　组培工作中需要配制一定浓度的培养基母液、灭菌剂，这也是植物组织培养工作的首要环节，一定要会使用相关的设备仪器，还要懂得各种化学药品性质，才能掌握各种药品溶液的配制技术。

　　1.1 准备工作

　　在配制药品前，要准备相应范围的电子天平，仔细核对各种药品，检查与润洗各种玻璃仪器和器皿。

　　1.2 操作要点

　　1.2.1 电子天平的正确使用及称量。称量前清洁、检查天平水平、调整零点;称量的最大量不得超过天平的最大负荷;具有腐蚀性的化学药品不得直接放入称盘内;称量值超过所需值时用纸筒慢慢摄取，然后关住天平侧门使其读数稳定，直至观察值达到所需值为准;打开或关闭天平门时动作要轻、慢、稳，以防影响最终读数;读数时必须关好天平门，防止气流影响;称量完毕后归零断开电源。

　　1.2.2 溶液混合与溶解。溶液混合时按其化学性质进行溶解，以防止沉淀的产生;溶解时要缓缓加入蒸馏水，不断用玻璃棒搅拌，注意玻璃棒不要碰到烧杯壁，分多次少量洗涤玻璃棒和烧杯并移入容量瓶中，如果是一定浓度的溶液注意刻度线的标线;对需助溶的物质(激素)加入不同助溶剂，微热使其充分溶解。

　　1.2.3 容量瓶配制精确物质的定容技巧。定容主要是用来配制标准溶液或稀释溶液的过程，是特指配制一定物质量浓度时的其中一步，具体可分为计算、称量、溶解、冷却、转移、定容、摇匀、贴签等几步。①检漏：检漏时，检查橡皮筋是否完好，加水至瓶口标准线附近盖好瓶塞，将瓶倒立30 s，观察瓶塞周围是否漏水，然后将瓶直立，把瓶塞转动180°后再盖紧，倒立，触摸瓶颈，仍不渗水，即可使用。②润洗：用蒸馏水润洗3～4次后再用待装溶液润洗，以保证定容后溶液的浓度不发生变化。③定容：引流时玻璃棒伸到刻度线以下;热溶液应凉至室温后对其进行稀释，因为温度升高会使瓶体膨胀，致使所量体积不准确;用少量蒸馏水冲洗玻璃棒、烧杯3～4次，洗出液全部转入容量瓶中，然后用蒸馏水稀释，接近容量瓶标线1～2 cm时用胶头滴管进行滴定以防定容失败;视线与溶液弯月面最低点恰好相切;容量瓶用完应及时洗涤干净，塞上瓶塞，并在塞子与瓶口之间夹一条纸条，防止瓶塞与瓶口粘连。

　　1.2.4 移液管移取母液的移液技巧。制作培养基时需用不同规格的移液管移取不同体积的母液。分度移液管应从最上面刻度起始往下放出所需体积，不能用多少体积就取出多少体积;管尖插入母液不要太深或太浅;当液面升高到刻度线以上时，快速移去洗耳球，立即用右手食指按住管口，将移液管提离液面，管尖垂直接触容器内壁，略微放松食指并轻轻转动移液管，直到溶液的弯月面最低点与颈标线恰好相切为宜，待溶液流尽停留15 s;如果移液管上标有“吹”字，则最后残留在管内的液滴必须吹出;使用完移液管，清洗其内外壁，再放回原处;清洗、移液过程中溶液不能滴到桌面、地面。

　　2 培养基制作技术

　　培养基是植物组织培养的“血液”，其成分及供应状况直接关系到外植体的生长与分化。采用更适于植物生长的培养基提供植物材料生长发育需要的养分和生长调节物质。常用的培养基有MS、1/2MS、White，现以MS为例介绍其制作、分装与灭菌的操作技术。

　　2.1 准备工作

　　进行培养基制作前，将所需要的量筒、烧杯、吸管、玻璃棒等仪器放在指定位置。使用前仔细观察母液是否变色或沉淀以及各种母液的名称、浓度、配制日期。称量琼脂、蔗糖，准备好蒸馏水以及培养瓶等。

　　2.2 操作要点

　　取适量的蒸馏水放入容器，微热使琼脂充分溶化呈现半透明状，加入蔗糖待其完全溶解，将移取的各种母液加入容器内，并用玻璃棒搅拌使其混合均匀，定容，调整并测其pH值3～4次，最后进行分装、灭菌。

　　2.2.1 pH值。MS培养基的pH值由灭菌前的5.8降到5.5，造成pH值下降的最主要原因是高温灭菌过程中EDTA铁盐与其他微量元素发生相互作用所致。MS培养基的凝固与pH值呈正相关。当pH值低于5.5时，培养基一般不能很好地凝固，随pH值的提高，培养基的凝固效果明显改善。植物组织在一定pH值下才能正常生长。因此，在配制时考虑培养基凝固情况的同时，也要注意pH值的大小。

　　2.2.2 分装。分装时要掌握好分量，以注入培养容器的1/4～1/3为宜。分装时不要将培养基沾到瓶壁上，分装后立即上盖，做好标记。

　　2.2.3 高压湿热灭菌。培养基采用湿热灭菌法，把分装好的培养基置入高压锅中，排列均匀，瓶间留有一定空隙，关闭锅盖，接通电源。当压力升至0.11 MPa(温度121℃)时，维持15～30 min，断开电源。当压力降到“0”时，打开排气阀，排掉剩余蒸汽，打开锅盖取出培养基。

　　3 灭菌与清洗技术

　　在组织培养过程中消毒、灭菌是不可忽视的环节。消毒、灭菌将外植体、接种器材、接种室等带有的细菌杀死以减少污染，提高试管苗成活率。

　　3.1 灭菌

　　3.1.1 外植体灭菌。采集的外植体沾有很多污染物，在接种前必须将其放在自来水下冲洗1 h，并将比较大的外植体剪小，进行初步处理以利于在容器中放置和接种过程的操作;将外植体带入无菌操作室，用75%酒精溶液浸泡10～30 s，然后用0.1%升汞溶液浸泡30 min，用无菌水冲洗3～5次，将外植体上的水珠用无菌纸吸干，然后进行接种。

　　3.1.2 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。接种过程中可将镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%酒精中，使用前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后立即使用。

　　3.1.3 玻璃器皿干热灭菌。干热灭菌是利用烘箱加热到160～180℃以杀死微生物。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥、包装，以免灭菌后取用时重新污染。烘箱内放置的物品不宜过多，以免妨碍热对流和穿透。

　　3.1.4 室内空间紫外线和熏蒸消毒灭菌。①紫外线灭菌：在无菌操作间、超净工作台用紫外线灭菌。紫外灯距照射物1.2 m以内紫外线杀菌能力最强。②熏蒸消毒灭菌：熏蒸消毒灭菌可采用以下2种熏蒸方法：一是烟雾熏蒸剂。利用杀菌剂的烟雾进行空间消毒。将药物与易燃发烟物搅拌均匀，点燃后发烟但不能有燃烧火焰，通过杀菌烟雾扩散到房间各个角落，封闭门窗，杀菌效果好。二是气体熏蒸剂。利用甲醛溶液挥发进行空气消毒。将2%甲醛溶液(10 mL/m3)加入0.5%高锰酸钾即可挥发浓雾气体，散发至整个房间，封闭门窗1 d后通风，可达到很好的消毒效果。

　　3.2 清洗

　　3.2.1 新玻璃器皿。用1%盐酸溶液浸泡后用洗衣粉水洗涤，再用清水反复冲洗，蒸馏水淋冲，干燥备用。

　　3.2.2 用过的培养瓶。去除瓶内残渣将培养瓶用洗涤液浸泡，然后用清水洗涤3～4次，倒置于架子上至没有流水时转入烘箱中烘烤。

　　3.2.3 污染的培养瓶。首先必须高温灭菌后，再按常规方法清洗。

　　4 接种技术

　　表面灭菌后的植物材料经过切碎或分离出器官或组织，转接到无菌培养基上进行诱导培养及快繁。整个接种过程必须在无菌条件下进行。

　　4.1 准备工作

　　植物材料的选择和预处理、无染菌的培养苗、75%酒精、无菌水、漂白粉、培养皿，无菌纸、超净工作台、灭菌器、剪刀、镊子。

　　4.2 操作要点

　　在无菌环境下将植物材料在消毒的接种盘中剪成每芽一段，注意芽上切口离芽不要太近，一般在0.5 cm左右，芽下切口离芽也在0.5 cm左右。打开已准备好的培养基，在酒精灯无菌圈内接入植物材料，接种时植物材料上切口向上，下切口插入培养基中直立，使芽基部紧贴培养基，接种的容器中植入的数目不宜太多，以3～5个为宜，并保持一定距离，然后将盖子盖上。接种操作要时间短，速度快，技术到位，防止交叉污染。

　　5 植物组织培养操作过程引起污染的原因及对策

　　5.1 瓶苗污染与环境污染

　　5.1.1 造成污染的因素。培养基及各种使用器具消毒不彻底;外植体灭菌不彻底，有菌残存在细胞组织中;操作时人为因素带入和交叉污染;环境不清洁;超净工作区域污染等。

　　5.1.2 控制污染的措施。①器具灭菌：接种用的器具除经过高温消毒外，还需在接种过程中避免交叉污染，即用剪刀、镊子对植物茎段进行处理的过程中，每使用1次后，需在酒精灯火焰上灼烧或者插入灭菌器中，轮换使用。②接种过程：在接种过程中，很容易人为带入各种微生物，引起比较严重的污染。应注意以下几点：接种人员要注意个人卫生，特别是手要认真清洗，并用70%酒精进行消毒，还时常用酒精棉球擦手;用70%酒精擦拭需继代转接的培养瓶;在操作区内，不要放入过多的待用培养基，避免气流被挡住;接种者应当熟练操作技术，做到操作娴熟、干练。

　　5.2 接种前后对环境的灭菌

　　接种前打开无菌操作室的紫外灯照射30 min，同时打开超净工作台的紫外灯和风机，在操作时关闭紫外灯并调小风速;接种结束后将植物垃圾带出操作室，并用75%酒精溶液进行拖地，操作结束后打开臭氧发生器定时30 min对整个环境进行灭菌。

　　环境污染也会使各个环节的污染明显增加，严重时会使植物组织培养工作无法进行。环境要进行定期的熏蒸消毒，一般用高锰酸钾和福尔马林;在接种室和培养室内，平时还需要紫外灯照射消毒;减少环境污染除加强灭菌外，平时应天天清扫，使环境清洁有序。

国内外植物组培技术在发展上的差距

植物组织培养技术即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，是生物技术中最早实现产业化并取得显著经济效益和社会效益的领域。但由于先天的不足，总得来说，目前我国仍处于追逐国际的状态。

国外科学家较早地深入研究植物组培技术，自从1902年德国科学家Gotdieb Haberlandt提出植物细胞的全能性理论后，细胞全能性研究逐渐成为生物学研究领域的热点，而建立在细胞全能性基础上的植物组织培养技术从此逐渐兴起和发展。如：1934年，美国White通过对番茄离体根的培养，形成了第一个可以正常生长的无性系，从而使非胚器官的培养首先获得成功；1937年，White以种间杂种烟草茎段的形成层为材料，成功地进行了植物组织培养和继代培养；1943年，White出版了专著《植物组织培养手册》，标志着植物组培技术开始成为一门新兴的科学和技术。此后，更多的国外科学家和学者对植物组培技术不断地进行探索与创新，并建立的许多重点实验室和公司，实现了组培的产业化。而我国对此却鲜有贡献，仅于1933年，李继侗进行银杏的离体培养时，证明了大小约3mm的幼胚能正常生长。当然，不能以此否定完我国的组培技术。20世纪70年代，我国学者首先完成了20多种植物的花粉培养，使我国在这一领域处于世界领先地位。

当前，植物组织培养技术在我国也得到了快速发展，广泛应用于植物育种、植物脱毒和快速繁殖、植物有用产物生产、植物种质资源保存和交换、遗传、生理、生化和病理研究。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将为社会创造更大的价值和效益。但由于先天的不足，总得来说，目前我国仍处于追逐国际的状态。

一、技术创新上的差距

1、在研究的系统性方面

国外研究品种多，不仅研究种间差异，还研究无性系间的差异。我国虽研究范围广，但系统性差。目前几乎所有现赏植物都曾进行过组织培养，但多数局限干培养的最终结果或围绕结果的几个重要因素的研究。

2、在研究的深度方面

国外除了研究通过植物组织培养各种途径再生植株外，更为重要的是对植物组织培养苗各阶段的生长特性，遗传稳定性及组培苗田间表现等方面进行了研究。而我国继代培养的代数普遍偏长，且很少追踪组培苗田间表现的研究。

3、在技术环境及条件控制方面

国外在组织培养技术及培养环境条件控制方面的工作做得更细，更精，根据不同种类，不同生长阶段在培养条件上进行不同控制。这些研究对于促进植物组培快繁技术体系的完善和实现组培苗商品化、工厂厂化生产都是十分必要的。国内有关组织培养方面的研究报道，重复性研究很多．但试验结果的可重复性较差，多数报道只有结果，对所采用的技术手段和原因分析较少。

4、在培养方式方面

发达国家采用穴盘营养液无糖培养方式．有效地降低了成本，其培养室内的光照，光质，光周期，温湿度、二氧化碳浓度等全部采用自动控制。而我国多数还是采用基质容器的粗放培养。

二、产业化的差距

1、在技术与产业结合方面

发达国家特别注重产业化，从事组织培养的研究机构都与产业相结台，他们征实验研究、开发推广到生产试验上的经费投放之比为1：10：lOO。而我国的研究机构大多游离于产业之外，使技术和产业分离。加之科研主管部门的研究经费大多投入在前期的基础研究上，而对中试和进一步产业化的投入则远远不足，这就是导致我国目前组培育苗产业化程度不高的主要原园之一。

2、在污染率控制方面

国外新型工厂化组培苗的生产，从培养基的制备、消毒、存储，植物的接种、培养、观察等都是在无菌工作间进行的，降低了污染率，提高了工作效率。而在国内，由于资金有限，除了在接种台上必需的无菌操作外，其它的都是在自然空气中，加之培养室环境控制不好，污染率较高，致使损失严重。此外，国外组培设施设备、环境条件和人员素质优于我国，对组培产业化生产的管理比较规范，并使用比较合理的防污染药剂，组培的污染率可以控制任5％以内。但我国组培室周围大都没有隔离，组培苗的污染率往往超过5%。还有就是缺少管理经验，对污染的危害性认识不足，缺乏对污染源的诊断与对症下药。

3、在生产自动化程度方面

在组培产业化中为节省人工，减轻强度，国外已开始在培养基容器的清洗，培箨基配制、分装、灭菌和搬运中建立自动化和半自化生产线和设备。现代他的智能化温室较普遍用于植物组培苗的移栽，并用电脑进行自动控制。而国内目前组培苗的生产尚未实现机械化与自动化。仍以人工为主，存在速度慢、劳动强度大，成活率低。生产成本高等问题。

4、在订单生产方面

国外的组培公司都是按订单进行生产，国内普遍存在组培计划，生产段销售脱节问题。组培苗工产业化生产是一个系统[程，只要其中的任何一个环节出现问题，都会影响到整个生产计划和任务的完成。所以在制定计划时要充分考虑到各种可能发生的情况，同时又不能能把余地留得太大，以免生产过多造成浪费和增加成本，或者不能按订单提供相应的产品。

5、在监测技术体系方面

荷兰已着手对组培质量监测技术体系进行研究。设在荷兰的SBW组培实验掌研究项目负责人彼得范德林特指出，为保证培养及生产工序的质量，必须实施一套标准化程序。范德林特说，质量包括很多方面，但有两个因素是非常重要的：一是产品的质量，另一个是生产工序的质量。而后者可以通过世界公认的生产标准认证如ISO或HACCP得到保障。关于组培技术标准方面，在国际上由于大多数大的组培工厂都是公司性质，出于商业机密，基本不将组培技术标准公布于众。到目前为止，尚未见有国际标准、国家标准。

6、在人员培训方面

农业发达的国家和地区，农业专业技术人员都是经过严格培训的，而我国除了少部分农业技术员有机会接受专业技术培训外，大多数从事农业的人员都没有得到很好的培训。特别是组培业，很多参与组培厂管理和技术工作的人员都是工作后才真正接触组培，边工作边学习。少部分专门从事组培研究的专家却不能直接参与生产和管理，使得技术和管理不能有机地结合，从而影响了产效，尤其是能有机会出国接受专业培圳的人更是微乎其微。这种状况也影响了我国组培产业的研究和发展。

7、在与其它新技术结合方面

国外组培产业也开始向规模化、产业化、综台化和多样化发展，并与计算机技术、信息技术自动化技术以及新材料结合，不仅进行植物的组培快繁，而且通过信息网络，进行组培生产和经营管理，以节省时间，提高生产效率，使组培产业化能持续健康发展。而国内组培事规模和档次不一，有的规模投入过大，设计不科学，装备不配套，难以以堵转和赢利；有的过于简陋，规模太小、难以投入生产使用；有些组培室建成后，由于缺乏市场、技术、人才和管理，处于闲置状态。