植物组培灯(植物组织培养中常见的问题及防治措施)

Posted 2023-05-30

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植物组培灯(植物组织培养中常见的问题及防治措施)

1.微生物污染问题

1.1造成污染的原因

（1）外植体材料本身带菌；（2）接种过程中接种工具灭菌不彻底或者交叉污染；（3）培养基灭菌不彻底。

1.2防治措施

（1）外植体灭菌要彻底。首先可以选择组织内部无菌材料；其次根据不同的材料选择不同的消毒剂和消毒时间；第三外植体消毒要细心，比如茎段消毒，经过消毒处理后，要把两端切去约0.5cm，这样就可以大大减少污染的概率。

（2）严格遵守无菌操作规程。操作人员在进入接种室前一定要洗手，然后换上接种服，带上口罩，操作之前先用75%的酒精擦拭双手，接种工具要经常灼烧一保证不会带菌或者交叉污染。

（3）加抗生素。在培养基中适当的加入抗生素可以有效防止污染。

（4）无菌培养环境。培养室内要定期进行灭菌，可在室内装紫外灯，或者用高锰酸钾和甲醛熏蒸，或者利用其它的熏蒸剂进行灭菌。

（5）控制外植体的接种数量。每个培养瓶中尽量接种少量的外植体。

（6）及时继代培养。定期检查组培苗的生长情况，发现有污染苗头的组培苗及时转接到新鲜培养基上。

2.褐变问题

2.1影响褐变的因素

（1）外植体材料的基因型；（2）外植体的生理状态；（3）培养基成分。

2.2防治措施

（1）选择适当的外植体。选择处于旺盛生长状态的外植体，对于容易褐变的植物注意对其不同品系的基因型进行筛选，选择褐变率较低的材料作为外植体。

（2）在培养基中加入还原性物质或者吸附剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸等抗氧化剂；或者加入0.1-1%的活性炭吸附培养物在生长过程中分泌的酚类、醌类物质，但是要注意活性炭也可以吸收培养基中的激素使之浓度降低。。

（3）对培养材料进行预处理。用抗氧化剂溶液进行预处理或者在接种前用无菌水洗净切口渗出的酚类物质。

（4）适当的培养条件。在培养初期保持较低温度（15-20℃），可以降低PPO活性，防止酚类物质氧化，减轻褐变。

（5）其他措施，培养初期进行连续转接。

3.玻璃化问题

3.1影响玻璃化的因素

（1）外植体材料；（2）培养的环境条件；（3）培养基成分，琼脂的浓度、碳源的种类及含量等；（5）封口材料。

3.2防治措施

（1）降低NH4+浓度，减少培养基中氮化物的含量。

（2）降低细胞分裂素的含量。

（3）适当增加琼脂的浓度，以降低培养基的水势。

（4）增加光照强度和光照时数。

（5）在培养基中加入5-10mg/L的PP333。

1．两次培养基用的配方都一样，为什么一个凝固的特好，一个就凝固不了？

答：培养基的凝固与否无外乎有下列几种情况：

（1）．琼脂批次有变，没有做批次试验，沿用以前的用量造成不足。

（2）．大量元素重复加入，或大量元素母液配制时出错。

（3）．pH值调得过低，或有活性炭高压灭菌时间过长，造成蔗糖分解量剧增，影响培养基的pH值降低较多。

（4）．加入新的天然附加物，或附加物过多。

2．75%的酒精和70%的酒精有什么区别，组培时用哪种好?

答：酒精的70%和75%都是可以的，但往往由于桶装酒精的浓度达不到95%，这样按照70%的配制就达不到要求了，因此我们一般是桶装按照75%的配，瓶装则按照70%的配。

3．大型灭菌器在灭菌的时候总会出现个别瓶子破裂的现象，请问什么原因？是温度过高，压力过大，还是内部冷热不均造成的呢？

答：高压灭菌造成玻璃瓶的破裂，特别是大型灭菌装置，我想最主要还是在放气冷却时造成的。究其原因，应该是在放气时，由于容积较大，压力在不同位置（内外部）的变化速度并不相同，致使瓶内与瓶外的压力差距较大，如果是封口膜，表现的可能就是塑料膜的破裂。

4．初代培养时，外植体出现发白，慢慢枯死，是什么原因？

答：外植体的初代培养出现这种情况，是比较好理解的。大田植物材料离体以后，进入不同环境中继续生存代谢，需要一个过渡。首先，植物材料要吸收培养基的养分，不再是根吸收，盐类浓度相对于离体的植物材料的吸收能力可能是过量的，植物材料褪色就是叶绿素形成受阻和细胞代谢受阻，另外还有培养基养分供应的有效性滞后，另外还有植物材料本身内含物向培养基的流失等等。建议在初代培养阶段最好先采用空白培养。

5．做无毒苗的快繁，一直找不到合适的培养基，能不能帮我推荐一种？

答:关于组培快繁的方式概括起来有下列两种途径：

（1）、外植体－愈伤组织－再生芽－继代－生根－出苗

（2）、外植体－丛生芽－继代－生根－出苗

至于采取哪种途径，需要彻底了解所选组培植物的生物习性，包括繁殖方式，顶端优势，萌孽生根能力等。

6．一般情况下KT的母液应该配成多大浓度？IAA能高压灭菌吗？高压灭菌成分会变吗？

答：KT一般配成0.05－0.1ppm。IAA极不耐高压灭菌，一般采用过滤灭菌。

如果利用高压灭菌剂分解率会在85%以上，致使其作用不明显。

7．请问植物病毒检测的简便方法？

答：由于经过脱毒处理，即使未完成脱除病毒的植株，其体内病毒的含量也会较低，常常在最初的一、二次病毒检测中呈阴性，因此有人建议在前18个月内，必须对植株进行若干次检测。目前常用的植物病毒检测方法有可见症状鉴定、寄生鉴别、抗血清检测、电镜检测、分子检测等。可见症状鉴定法较简单，但准确性差，对于不表现可见症状的隐症病毒几乎无效；而电镜检测、分子检测虽然检测准确率高，但设备昂贵，尤其电镜不可能每个组培室都配备，故未在生产上广泛运用；目前生产上，国内外仍主要采用鉴别寄主的酶联免疫检测法检测植物病毒。

8．组培苗生长环境有何特点？如何针对这些特点提高移栽成活率？

答：组培苗炼苗是组培过程中较为重要的一个环节，是一个较为复杂的技术体系，提高炼苗成活率是决定组培成败和降低组培成本的关键。试管苗一般在高湿（100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒温（25℃）下培养，生长的植株有以下几个特点：（1）、叶片无保护组织（角质层、蜡质、表皮毛等），加之细胞间隙大，气孔开张大，因此水分散失较快，易于萎蔫。(2)、根无根毛或极少，并且有些从愈伤组织上发育的根与芽的疏导组织不相同，因此吸水能力较弱。而当炼苗移栽时，环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大。具有以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。另一种情况是，空气温度上升要比基质温度上升快，而根系的吸水能力在一定范围内与温度是成正比的，当气温升高时，加之湿度较低，叶片蒸腾急速增加，此时基质温度上不去，根系吸水能力不够，造成蒸腾大于吸水的失衡状态，从而萎蔫死亡。要想获得高的炼苗成活率就得针对以上问题，一方面提高出瓶苗的质量，提高其抗逆性，生根前的壮苗、理想的生根配方和生根培养环境的调控是关键；另一方面就得有针对组培苗特点创造一个适宜的炼苗环境，比如保证空气湿度，平衡空气和基质的温度平衡关系等。

9．有些植物在组培生根阶段会把大量元素和糖减半，根据什么来判断是否需

要减半？

答：在组培过程中，我们提起配方往往只局限于激素的配比和添加物的使用，

其实对基本培养基的构成和培养条件（温度、光照、湿度、PH等）都属于配方的范畴。在这方面的调整主要是根据实际培养状况灵活调整。在生根阶段，试验证明培养基高渗透势或液体培养基有利于营养素和激素的运转，有利于根的发生和形成，因此大部分植物在生根过程需要调整基本培养基的组成。但具体需不需要应该通过对比试验确定。

10．什么是滤纸桥生根？

答：1）滤纸桥生根技术是分化苗直接瓶外生根技术，其作用主要是简化生根环节，提高炼苗成活率，降低组培成本，同时还可以对污染苗进行最大程度的利用。

11．人工种芽的形成标志是什么，怎样才能算是一个完整的人工种芽？

答：一个完整的人工种子是由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三部分组成。

它的优势在于：(1)、培养条件可以人为控制，省地省工，可直接播种。(2)、人工种子制作时，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等。(3)、以用于生产人工种子的体细胞胚，可以利用生物反应器大规模生产，效率极高。(4)、一些珍贵种苗或树种可以通过人工种子，加速其生产应用。

存在问题：(1)、并非所有植物都能培育出大量高质量的体细胞胚。(2)、目前的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效防止微生物的腐蚀。(3)、人工种子的贮藏问题有待于进一步完善。

12．在组培中胚状体在外部形态上是如何与愈伤组织区别的？

答：大量实验证实，植物体细胞具有成胚的潜力，由体细胞形成的胚状体叫体细胞胚。一般情况，体细胞组织形成愈伤组织之后3周内，在愈伤组织上出现大量胚，这些胚是由愈伤组织外层细胞以及深部细胞起源的。在离体或活体条件下，体细胞经原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期等阶段形成的胚叫体细胞胚状体。从外植体或愈伤组织表面产生胚状体的情况较为常见。

从愈伤组织向球形胚过渡的标志是细胞的活跃分裂形成一团致密的没有表皮层

的细胞团结构，可以明显地与疏松的愈伤组织区分开。

鉴别胚状体的标准：（1）胚状体具有极性，也就是说胚状体在发育的早期阶段，在其相反的两端分化，分别出现茎端和根端，是一种单极性结构。（2）在组织学上，胚状体的维管组织与母体植物或外植体的维管组织一般没有联系，

其维管组织的分布呈“Y”字形。而根或芽的分化，里面长出原形成层束，与愈伤组织形成的或外植体中的维管组织往往相连。

13．如果在配制母液时，将大量元素和微量元素掺在同一个罐子内，会对植物有影响吗？

答：母液配制，主要是考虑到母液稳定性问题，根据化学反应原理，浓度很高的大量元素中的阴离子，对微量元素的金属离子来说是过量的，因此若混在一起，微量元素中的金属离子会很容易发生水解反应，生成沉淀，从而失效。长时间使用这样的母液，就会发生生理病害，比如缺素症（黄叶，叶不展，萎缩变脆等）。建议使用干粉式培养基。

14．植物组织培养的培养基为什么只用蔗糖而不用葡萄糖？为什么动物培养的培养液中用葡萄糖而不用蔗糖？

答：这个问题我觉得应该从植物与动物的生理机制去思考。植物与动物的最大差别就是植物是自养型的（光合作用）而动物是异养型的（外部吸收代谢）。植物光合产物是多糖（二碳糖以上，包括蔗糖），贮藏产物形式是淀粉，而淀粉的合成前体就是蔗糖。蔗糖＝葡萄糖＋果糖，所以蔗糖的合成必须同时要有葡萄糖和果糖，其实植物也只能吸收葡萄糖和果糖。在组织培养中加入蔗糖，经熬煮和高压灭菌后就会分解成植物能够吸收的葡萄糖和果糖形式。其实这样看来在组培中，植物也有部分异养的特点，如果在培养基中缺少任何一种糖的形式，植物在自养能力（光合，呼吸，产物代谢等）较差的情况下，就难免会影响其生理代谢。与植物不同的，动物是异养型的它不需要淀粉的积累，也没光合作用，动物细胞本身所处的生理环境和代谢方式就决定了它对糖形式的要求了。

15．如何利用组培技术培养一棵未知植物？

答：作为未知植物的组培，我想应该归为珍稀植物材料的范畴。一是数量有限，二是不曾命名，三是无文献可查。这种材料如果性状优良，进行组培快繁是相当必要的。一般可以通过以下步骤开展工作：（1）、观察植物的生物学性状，进行植物归类和属种划分。（2）、确定植物的繁殖方式（分蘖、种子、扦插、根茎等），比较组培繁殖的优势。（3）、根据植物特性（顶端优势，萌蘖能力等）确定组培发生方式。（4）、小量无菌外植体系的建立，确定高效外植体获得方法。（5）、大量外植体群体建立，诱导分化配方设计。（6）、确定最好分化的继代配方。（7）、生根配方设计与确定。（8）、试管苗出苗。（9）、大田栽植，观察组培苗生物学性状，与母本比较鉴别，确定优良性状的遗传稳定性。（10）、工厂化繁殖，市场化运作。

16．在初代培养阶段，成功地诱导出绿色的愈伤组织；进行继代培养时愈伤组织增殖很快，却始终没有出芽，如何解决不产生不定芽的问题？

答：愈伤组织诱导成功后，如何有效地诱导出不定芽是相当重要的。外植体产生愈伤组织的时间和愈伤生长的程度，随不同植物种类和培养条件有较大的差异。有些植物形成不定芽比较容易，能够直接从外植体受伤的或没有受伤的部位分化出不定芽。一般认为细胞分裂素/生长素的比值是控制器官发生的重要因素，调整他们的适当比值就可以有效的控制愈伤组织的芽、根等器官的分化。在此理论下，愈伤组织诱导不定芽的能力，与愈伤组织的状态密切相关，能够诱导形成分生细胞团至关重要，分生细胞排列较为规律，较大的在外，越向内细胞越小，排列也越紧密，细胞质浓厚，核相对较大，这样的分生细胞在激素比值调控的情况下，就很容易形成不定芽。这也就是为什么愈伤组织在继代的时候要交替使用不同激素的原因。

17．NAA和2，4-D哪个生长素促进愈伤诱导效果更好？

答:对于愈伤诱导和增殖来说，2，4－D效果要比NAA明显；但有一个问题，很

多情况下，2，4－D诱导的愈伤比较难以再生芽。

18．灭完菌，凝固好的培养基上面会有一层水是什么原因？如果将植物材料转接于这样的培养基中，会有什么后果？

答：培养基灭过菌后或多或少会有积水现象，一般来说冬天要轻一些。如果积水太多接种的时候倒出来，不然容易造成容器壁水珠比较多，影响光照，从而造成玻璃化现象加重。

19．在组培中，叶片较易脱落，是什么原因引起的呢？

答：叶片脱落是对逆境的一种表现，温度过高、透气不良、培养物过于密集、久不转移、有害气体积累（乙烯、氨气、甲醛）等会引起植物材料的落叶或黄化。

20．空白培养是什么意思？

答：空白培养在高效外植体系的建立方面是很有用的步骤，空白培养就是不加任何激素的培养过程。对于外植体迅速适应瓶内环境和有效外植体群体的建立是很有用的。

21．如果芽体只是长高，不膨大也不分化，有的静止不动，请问这会是什么原因引起的呢?

答：成活外植体如何成功启动是组培过程中至关重要的环节之一。由于大田植物材料其激素水平和细胞活性差距较大，如何迅速将外植体对培养基条件做出反应也有很多方法，首先芽体萌发时应用赤霉素，黑暗培养，高低激素配合使用等都会起到很好的效果。

22．用幼芽启动用于分化芽的愈伤，NAA与6-BA的比例有一般规律吗？还有用2，4-D启动的愈伤再转到只含NAA和6-BA的培养基中，愈伤变为绿色，有分化的可能吗？

答：离体的愈伤组织是一种正在增生的非组织化的细胞群，可以从几乎任何类型的植株获得。由外植体形成愈伤组织很少是自发的，它代表创伤反应的扩展，一般要求在培养基中有生长素，常常还要求有细胞分裂素同时存在。最有效地产生愈伤组织的激素浓度随所用的植物及器官而异，但其比外植体直接诱导苗所需的浓度要高。大多数植物中愈伤组织可从外植体上分离开，并可进行继代培养和连续繁殖，所使用的培养基中所含的激素水平，与用于诱导愈伤组织时相同。如果降低激素水平，或适当调节生长素对细胞分裂素的比例，某些愈伤组织将再生出苗或胚。

23．洋葱也能加在培养基中？能说说它的机理吗？

答：培养基中添加有机附加物，如马铃薯、香蕉、椰汁等，主要是由于他们含有丰富的糖、蛋白质、各种无机盐、维生素以及各种活性物质。洋葱也不例外，除了含有丰富的营养物质之外，洋葱还含有丰富的硫化合物，是强有力的抗菌成分，能杀死多种细菌。

24．在壮苗生根培养基中培养，会有黄叶出现，叶子都枯了。是什么原因引起的?

答：组培苗的黄化是由培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的，但这样的解释是比较抽象的。我觉得在壮苗生根阶段，由于培养基的变化，特别是激素的改变导致培养基高压灭菌后PH变化与分化阶段是有较大差别的，加之苗子与培养基接触面积的变小，营养供应滞后。所以当根长出来以后，会有不同程度的改变。如果解决的话，还应该确定一下生根培养基高压灭菌后的pH变化，进行适当调整，同时在分化时进行适当壮苗调整也是比较好的方法。

25．请问：（1）接种前，接种工具要浸泡在酒精中，所使用的酒精浓度是75%还是95%？（2）我用新铁炮百合鳞片作外植体，对鳞片切割有没有什么方法可以减少污染，书上讲根据极性方向接种到培养基上，怎么判断极性呢？（3）使用玻璃瓶和不锈钢的盖子作为培养容器，透气性是不是不好，会影响培养效果吗？

答：接种工具接种灼烧前浸泡酒精的浓度，可以是75%也可以是95%的。至于极

性指的就是植物材料有趋向发育的特征。比如是茎繁，靠近茎顶端发出芽子，

远离茎顶端会长出根。是根繁的话，新芽发生于近心端，新根发生于远心端。因此在接种时，尽量不要使材料倒置，尽量保持植物的极性方位，不能将茎端插入培养基内。培养容器的透气性是决定瓶内湿度和气体状况的主要因素，因此如果过于密封，使瓶内外得不到气体交换，就会不同程度的受到影响。建议使用透气性好的培养容器。

26．生化培养箱可以进行植物组织培养吗？它与光照培养箱有什么不同？

答：光照培养箱主要是模拟植物的光照条件，更适合植物的培养、种子发芽等的实验，而生化培养箱更偏重于温度、湿度的控制，微生物实验等比较合适。

27．高压灭菌后培养基的pH会变大还是变小？MS和1/2MS哪种培养基pH变化更大？

答：培养基灭菌后pH会降低0.2左右，其主要原因就是有机物的分解，特别是维生素、氨基酸和糖，因此MS会比1/2MS培养基pH变化更大。

28．内生菌造成的污染在外观上怎么辨别？

答：内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起的污染称为内生细菌污染。从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。

29．水解酪蛋白有酸水解，有酶水解，在使用过程中有没有区别，他们的在培养基中的作用是一样的吗？

答：水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）是多种氨基酸的混合物，对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量在500mg/L，特别是当有高水平IAA存在时更是如此。对于酪蛋白不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，但考虑到组培苗的异养功能，酸解应该更有利于发挥其作用。

30．有些树种受伤后会分泌出一些白色的浆液，比如梓叶槭，不管是茎段还是叶片，只要有伤口的地方都会有浆液，而这会加重外植体的褐化，请问应该怎么处理呢？

答：这是植物的伤流现象。由于伤流液中含有酚类物质，因此在培养中极易引起褐变。许多研究表明，选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要手段。通常外植体应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化和再分化培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。适宜的温度和在全黑暗条件下进行培养也可显著减小外植体的褐变。液体培养和连续转接也是很好的措施。另外，加入一些氧化剂或用抗氧化剂进行材料（外植体）的预处理或预培养，可大大减轻醌类物质的毒害。这些抗氧化剂包括：VC、柠檬酸、硫代硫酸钠等。此外，0.1％-0.5％活性炭对吸附酚类氧化物的效果也很明显。