核移植的生物学原理(体细胞核移植技术的影响因素)

体细胞核移植技术的影响因素

吴姣1 张丽2 霍永3 硕士

摘要：体细胞核移植是近年来人类在发育生物学个和细胞生物学领域所取得的最强大的成果之一，然而该项技术成功率低，技术研究薄弱，因此，分析体细胞核移植技术存在的问题，成了近年来体细胞核移植技术的研究重点。本文分析影响核移植成功率的影响因素，为核移植技术的进一步完善提供了理论基础。

关键字：体细胞核移植、影响因素

自1997年英国科学家Wilmut拉开了体细胞核移植时代的序幕以来，先后在小鼠、牛、山羊、猪、猫、兔等动物上获得了成功。尽管体细胞核移植在理论研究和技术完善方面取得了长足的进步，但克隆效率低的瓶颈依然无法突破[1]。因此，为了提高核移植效率探讨其影响因素，对核移植的关键环节进一步优化，已成为提高核移植效率的一个研究方向。

1、供体核影响因素

1．1供体核的类型

用作供体的体细胞是核移植的主要核心部分，也是影响移植成功率的主要因素之一。自从体细胞核移植技术诞生以来，已经使用过多种类型的体细胞，所使用的体细胞分化程度越低，发育后期胚胎的基因重编程越容易，重组胚的发育潜力越高。目前研究应用比较广泛的成体细胞是生殖系统的细胞、胎儿成纤维细胞和成体成纤维细胞。卵丘细胞在G0/G1期时处于自然静止状态，染色体端粒较短，但细胞内端粒酶活性较高，细胞不会因为染色体端粒的变短而老化[2]。胎儿成纤维细胞来源广泛，分化程度低，复制速度较快且不易衰老。Hill用牛的胎儿成纤维细胞作为供体核制作核移植胚胎，体外培养18代后制作的重组胚发育率与第3代相比差异性不显著[3]。且胎儿成纤维细胞转染基因的有效性强，常被用作供体核进行转基因动物的研究。相对于胎儿成纤维细胞，成体纤维细胞具有取材方便，对消化液比较敏感的优点，且易得到纯化的细胞。目前使用尾尖成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、乳腺上皮细胞及心肌成纤维细胞等，都成功取得核移植后代[4]。

1．2 供体核周期

供体核的DNA合成情况与其所处的细胞周期相关， 处于G0/G1期的细胞为二倍体核，发生核编程时能够在第一次细胞分裂的末期维持正常的染色体倍数。许多研究者也支持这个观点。诱导供体细胞进入G0/G1期阶段的方法主要有细胞分选法、血清饥饿法、周期抑制剂、接触抑制法等，血清饥饿法最为常见。有人认为使用血清饥饿发会引发不同程度细胞凋亡，但大多数结果显示，经过血清饥饿处理过的供体细胞处于G0期利于重构胚发育[5]。而处于G2/M期的细胞用作供体核，染色质发生成熟前染色质凝集（PCC），很大程度会形成四倍体，经复制形成八倍体染色体，胚胎无法正常发育。人们还是更倾向于使用处于G0/G1期的细胞作为核移植的供体细胞。

1．3受体

在早期试验中，人们尝试使用卵母细胞、合子、早期胚胎等作为受体细胞用作核移植。研究结果显示，处于MⅡ期卵母细胞作为核受体后期发育情况较佳。MⅡ期卵母细胞胞质被称为“万能胞质”，胞质内MPF水平较高，能接受处于各个阶段的体细胞核甚至胚胎卵裂球或早期胎儿细胞，能够有效的构建重组细胞，能支持胚胎的全程发育 [6]。

2、卵母细胞的显微操作

去除卵母细胞的染色体-纺锤体得到卵母细胞胞质作为受体细胞，保证重构胚染色体正常，否则会影响重组胚的发育会受到阻滞。因此，保证重组胚正常发育的条件是得到既完整去除细胞核又减少卵母细胞胞质的损伤。Willadsen发明了三种去核方法：盲吸法、半卵法、功能性去核法；随后，人们以Willadsen去核法为基础，不断进行创新衍生出纺锤体图像观察系统去核法、染色示踪去核法、化学试剂去核法、点压法、末期去核法、蔗糖去核法等。

3、重构胚的培养

哺乳动物重构胚在体外培养时，培养液成分不适宜会阻碍胚胎发育。不同动物的培养液成分不同，小鼠胚胎常用CZB、牛羊胚胎多用SOF培养液。单纯的CZB或SOF培养液成分简单，不能提供胚胎早期发育需要的全部能量，添加能量底物（如血清、氨基酸、葡萄糖）可促进胚胎发育。血清作为常用的能量底物可以保持细胞活性并对胚胎的生长发育发挥重要作用，但血清成分复杂，对重构胚发育影响尚有不确定性。除添加能量底物外在培养液中添加辅助细胞（如输卵管上皮细胞、卵丘细胞等）进行共培养，通过辅助细胞分泌的营养因子有利于促进胚胎发育。其中以输卵管上皮细胞最长使用，并在猪、绵羊、小鼠等哺乳动物上能显著性提高早期胚胎的发育率[7]。在胚胎的体外培养系统中，使用共培养系统帮助胚胎渡过阻滞期的效果最为显著。

4、前景展望

哺乳动物体细胞核移植具有非常广阔的应用前景，从目前来看主要可从以下四个方面：（1）通过核移植技术大量扩增具有优良性状的个体，大大加速遗传改良和育种进程。（2）与转基因技术相结合。生产转基因动物，通过体细胞核移植技术，简化了转基因动物生产环节。（3）利用病人的组织细胞作为供体进行核移植，克隆出早期胚胎培养新的胚胎干细胞系，体外诱导分化后进行疾病治疗。（4）其他科学研究，如生产药用蛋白、保护濒危物种、培育各种疾病动物模型、[8]。我们有理由坚信，随着这项技术的不断完善，将会为人类带来巨大的福利。

参考文献：

1. 朱向星, 全守能, 黄勇,等. 体细胞核移植技术在猪基因修饰中的应用[J]. 基因组学与应用生物学, 2013(6):692-699. Gurdon J B, Uehlinger V. " Fertile" intestine nuclei.[J]. Nature. 1966, 210(5042): 1240.

2. Skrzyszowska M, Kątska L, Ry N Ska B Z E, et al. In vitro developmental competence of domestic cat embryos after somatic cloning: a preliminary report[J]. Theriogenology. 2002, 58(8): 1615-1621.

3. Hill J R, Winger Q A, Burghardt R C, et al. Bovine nuclear transfer embryo development using cells derived from a cloned fetus[J]. Animal Reproduction Science. 2001, 67(1): 17-26.

4. Burgstaller J O R P, Schinogl P, Dinnyes A, et al. Mitochondrial DNA heteroplasmy in ovine fetuses and sheep cloned by somatic cell nuclear transfer[J]. BMC Developmental Biology. 2007, 7(1): 141.

5. 纪慧丽, 卢晟盛, 潘登科. 体细胞核移植后表观遗传重编程的异常及其修复[J]. 遗传, 2014, 36(12):1211-1218.

6. 王海, 曾申明, 朱士恩,等. 培养介质、卵丘细胞和卵泡直径对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2002, 38(5):15-17.

7. 田长永, 杨景晁, 马泽芳,等. 卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2010, 41(5):543-548.

8. 匡颖, 徐国江, 王龙,等. 哺乳动物体细胞核移植技术研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2003, 23(12):43-47.