样品均质仪(实时荧光定量PCR实验操作流程)
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样品均质仪(实时荧光定量PCR实验操作流程)
一、实验器材及试剂
1、 实验器材
- 多样品研磨珠均质仪
- 台式高速冷冻型微量离心机
- 荧光定量PCR仪
- 超净工作台
- 分光光度计
- 离心管
- TIP头
2、 主要实验试剂及耗材
RNA提取液
三氯甲烷
异丙醇
无水乙醇
HyPure TMMolecular Biology Grade Water
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)
引物
75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制
离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥。
二、荧光定量PCR实验步骤
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆器中。
3）充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃ 下12000rpm离心10min。
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃ 放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃ 孵育5min。
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl 逆转录引物。
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4）于PCR仪上65℃ 保温5min，迅速置冰上冷却。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。
3、定量PCR
1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2× qPCR Mix12.5μl
7.5μM基因引物2.0μl
反转录产物2.5μl
ddH2O8.0μl
2）PCR扩增
预变性95℃，10min
循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s
熔解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃
4、结果处理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)
B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2-K
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