标本运输的生物安全(防控方案(第九版)新冠病毒标本采集和检测技术指南)

Posted 2023-05-29

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标本运输的生物安全(防控方案(第九版)新冠病毒标本采集和检测技术指南)

新冠病毒标本采集和检测

技术指南

　　为指导各级医疗卫生机构和其他相关机构规范开展新冠肺炎标本采集与实验室检测工作，确保检测质量，提高检测效率，特制定本指南。

　　一、标本采集

　　(一)采集对象。

　　新冠肺炎病例、可疑感染人员和其他需要进行检测的人员，以及可能被污染的环境或物品等。

　　(二)采样人员基本要求。

　　从事标本采集的技术人员应当经过生物安全和实验室检测技术培训，熟练掌握标本采集方法和操作流程，考核合格后方可上岗。采样时，应做好标本信息记录，严格遵守操作流程，确保标本质量符合要求、标本及相关信息可追溯。

　　(三)标本采集基本要求。

　　1.住院病例的标本由所在医院的医护人员采集，密切接触者标本由当地指定的疾控机构、医疗机构负责采集。采集标本时，要根据不同采集对象设置不同的采样区域，发热患者前往发热门诊就诊和采样。

　　2.确诊病例、无症状感染者、入境人员、密切接触者和密接的密接在住院、隔离观察或健康监测期间应“单采单检”，即单独采集个体的标本，单管进行核酸检测，不得进行混采混检。

　　3.根据临床及实验室检测工作的需要，可在住院、隔离期间多次采样，可同时采集呼吸道、血液、便等多种标本。采样人员应严格遵循采样规范，保障所采集标本质量符合要求，同时应详细记录受检者信息，可利用条形码扫描等信息化手段采集相关信息。

　　4.人群筛查应根据核酸提取、检测所用试剂的要求确定采样管，用于病毒分离的标本应放置于不含有病毒灭活剂的采样管。

　　5.物品和环境监测应根据监测目的和防控需求，确定采样物品、位置与数量，采样时应严格遵循采样规范。

　　(四)采集标本种类。

　　每个病例必须采集呼吸道标本(上呼吸道标本或下呼吸道标本)，重症病例优先采集下呼吸道标本；根据临床需要可留取便标本、全血标本、血清标本和尿标本。物品和环境标本根据监测需求采集。标本种类如下：

　　1.上呼吸道标本：包括鼻咽拭子、口咽拭子等。

　　2.下呼吸道标本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等。

　　3.便标本/肛拭子：留取粪便标本约10克(花生大小)，如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。

　　4.血液标本：抗凝血，采集量5ml，建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液。

　　5.血清标本：尽量采集急性期、恢复期双份血清。血清应当尽早(最好在发病后7天内)采集，第二份血清应当在发病后第3～4周采集。采集量5ml，建议使用无抗凝剂的真空采血管。血清标本主要用于抗体的测定，不进行核酸检测。

　　6.尿标本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。

　　7.物体表面标本：包括进口冷链食品或进口货物的内外包装表面，以及运输储藏工具等可能被污染的部位进行涂抹采集的标本。

　　8.污水标本：根据海运口岸大型进口冷冻物品加工处理场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处、污水井、污水流向的下游或与市政管网的连接处等关键位置对未经消杀处理的污水进行采样。

　　9.其它：已有唾液等标本用于新冠病毒检测的报告。

　　(五)标本采集和处理。

　　1.鼻咽拭子：采样人员一手轻扶被采集人员的头部，一手执拭子，拭子贴鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道呈弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周(如遇反射性咳嗽，应停留片刻)，然后缓缓取出拭子，将拭子头浸入含2～3ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。

　　2.口咽拭子：被采集人员头部微仰，嘴张大，露出两侧扁桃体，采样人员将拭子越过舌根，在被采集者两侧扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子头浸入含2～3ml病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。口咽拭子也可与鼻咽拭子放置于同一管中。

　　3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取呼吸道分泌物。将收集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采样液冲洗收集器一次(亦可用小儿导尿管接在50ml注射器上来替代收集器)。

　　4.深咳痰液：要求病人深咳后，将咳出的痰液收集于含3ml采样液的采样管中。如果痰液未收集于采样液中，可在检测前加入2～3ml采样液，或加入痰液等体积的痰液消化液。痰液消化液储存液配方见表1。使用时将储存液用去离子水稀释至50ml，与痰液等体积混合使用，或者参照试剂说明进行使用，也可采用痰液等体积的含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液将痰液化。

　　5.支气管灌洗液：将收集器头部从鼻孔或气管插口处插入气管(约 30cm 深处)，注入 5ml 生理盐水，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出，收集抽取的粘液，并用采样液冲洗收集器一次，也可用小儿导尿管接在 50ml 注射器上来替代收集。

　　6.肺泡灌洗液：局部麻醉后将纤维支气管镜通过口或鼻经过咽部插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其顶端契入支气管分支开口，经气管活检孔缓缓加入灭菌生理盐水，每次 30～50ml，总量 100～250ml，不应超过 300ml。

　　7.粪便标本：取 1ml 标本处理液，挑取黄豆粒大小的粪便标本加至管中，轻轻吹吸 3～5 次，室温静置 10 分钟，以 8000rpm离心 5 分钟，吸取上清液进行检测。粪便标本处理液可自行配制，配方见表 2。也可使用 HANK’S 液或其它等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液溶解便标本制备便悬液。如患者出现腹泻症状，则留取粪便标本 3～5ml，轻轻吹打混匀后，以8000rpm 离心 5 分钟，吸取上清液备用。

　　8.肛拭子：用消毒棉拭子轻轻插入肛门 3～5cm，再轻轻旋转拔出，立即放入含有 3～5ml 病毒保存液的 15ml 外螺旋盖采样管中，弃去尾部，旋紧管盖。

　　9.血液标本：建议使用含有 EDTA 抗凝剂的真空采血管采集血液标本 5ml，根据所选用核酸提取试剂的类型确定以全血或血浆进行核酸提取。如需分离血浆，将全血 1500～2000rpm 离心 10 分钟，收集上清液于无菌螺口塑料管中。

　　10.血清标本：用真空负压采血管采集血液标本 5ml，室温静置 30 分钟，1500～2000rpm 离心 10 分钟，收集血清于无菌螺口塑料管中。

　　11.物体表面标本：参考《农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范》(WS/T776—2021)推荐的方法，采样拭子充分浸润病毒保存液后在表面重复涂抹，将拭子放回采样管浸润，取出后再次涂抹采样，重复 3 次以上。对表面较大的物体进行多点分布式采样。

　　12.污水标本：采集污水的水体标本时，参考《污水中新型130冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》(WS/T 799-2022)，用无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为 300ml。可根据现

　　场条件和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样(采样点位某一时间随机采集的样本)或混合水样(同一采样点位不同时间所采集的瞬时水样混合后的样本)；如农贸(集贸)市场内排水沟内无法采集足够体积水样，可采集污水的拭子标本，参考《农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范》(WS/T776-2021)推荐的方法，用拭子浸入吸附污水，将拭子放回采样管浸润，取出后再次浸入污水，重复 3 次以上，对每个污水采样位置应进行多点分布式采样。

　　13.其他材料：如唾液等标本，依据检测需求采集。

　　(六)标本包装。标本采集后应在生物安全二级实验室生物安全柜内分装。

　　1.所有标本应当放在大小适合的带螺旋盖内有垫圈、耐冷冻的标本采集管里，拧紧。容器外注明标本编号、种类、姓名及采样日期。

　　2.将密闭后的标本装入密封袋，每袋限一份标本。标本包装要求要符合《危险品航空安全运输技术细则》相应的标准。

　　3.涉及外部标本运输的，应根据标本类型，按照 A 类或 B类感染性物质进行三层包装。

　　(七)标本保存。用于病毒分离和核酸检测的标本应当尽快进行检测，可在 24 小时内检测的标本置于 4℃(2℃～8℃)保存；24 小时内无法检测的标本应置于-70℃或以下保存(如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存)。血清标本可在 4℃存放 3 天，-20℃以下可长期保存。境外高风险区域人群以及新冠肺炎患者的密切接触者等人员的核酸检测标本，检测后，应当在-20℃保存 7 天。其他一般人群筛查标本，则可在 4℃保存24 小时。应当设立专库或专柜单独保存标本。

　　(八)标本送检。标本采集后应当尽快送往实验室，标本采集后室温(25℃)放置不宜超过4小时。如果需要长途运输，应采用干冰保藏，难以获取干冰时，可使用冰袋、冰排等低温运输。

　　1.送检标本。各省(自治区、直辖市)发现的本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性标本等所有原始标本应平行采集至少 2 份，一份送各省级疾控机构进行检测，另一份送中国疾控中心病毒病所进行检测、复核，同时附标本送检单(见附件 12-1)。各省分离到的新的代表性毒株，应及时送中国疾控中心病毒病所复核、保藏。

　　2.标本及毒株运输。

　　(1)国内运输。新冠病毒毒株或其它潜在感染性生物材料分类属于 A 类，对应的联合国编号为 UN2814，包装符合国际民航组织文件 Doc9284《危险物品安全航空运输技术细则》的PI620 分类包装要求；环境标本属于 B 类，对应的联合国编号为 UN3373，包装符合国际民航组织文件 Doc9284《危险物品安全航空运输技术细则》的 PI650 分类包装要求；通过其他交通工具运输的可参照以上标准包装。新冠病毒毒株或其它潜在感染性材料运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或标本运输管理规定》(原卫生部令第 45 号)办理《准运证书》。

　　(2)国际运输。在国际间运输的新冠病毒标本或毒株，应当规范包装，按照《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》办理相关手续，并满足相关国家和国际相关要求。

　　(3)标本和毒株的接收及管理。通过航空进行运送的标本抵达目的地机场后，由专业运输车辆运送至接收单位，通过陆路运输的标本由专业车辆进行运送，运送人员和接收人员应对标本进行双签收。

　　新冠病毒标本及毒株应由专人管理，准确记录标本及毒株的来源、种类、数量，编号登记，采取有效措施确保毒株和标本的安全，严防发生误用、恶意使用、被盗、被抢、丢失、泄露等事件。

　　二、新冠病毒的实验室检测

　　(一)检测人员要求。实验室检测人员应当具有实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过新冠病毒相关检验检测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成检测和结果报告。

　　(二)实验室检测。

　　1.实时荧光 RT-PCR 方法检测新冠病毒核酸。

　　(1)核酸检测实验室。新冠核酸检测实验室按功能区布置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开展新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。如采用标本加样、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，标本制备区、扩增和产物分析区可合并。集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立，单向流动(注意风向，压力梯度走向)，因地制宜，方便工作”的原则。各区的功能如下：

　　①试剂储存和准备区：用于分装、储存试剂、制备扩增反应混合液，以及储存和准备实验耗材。该区应配备冰箱或冰柜、离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为防止污染，该区宜保持正压状态。

　　②标本制备区：标本转运桶的开启、标本灭活(必要时)、核酸提取及模板加入至扩增反应管等。该区应配备冰箱或冰柜、生物安全柜、离心机、试验台、微量加样器，可根据实际工作需要选配自动化核酸提取仪等。标本转运桶的开启、分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压状态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立的生物安全二级(BSL-2)实验室进行，提取的核酸可以转运至该区加至扩增反应液中。

　　③核酸扩增和产物分析区：进行核酸扩增反应和产物分析。该区应配备实时荧光定量 PCR 仪。为防止扩增产物污染环境，该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。

　　(2)新冠病毒核酸的荧光定量 RT-PCR 检测。实验室应当制定标准操作程序(SOP)，并严格按照 SOP 进行操作。接到标本后，应当在生物安全柜内对标本进行清点核对，并依据 SOP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检的流程。

　　①试剂准备。应当选择国家药品监督管理部门批准的试剂，建议根据核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管，不建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。

　　②标本处理。使用含胍盐等灭活型采样液的标本无需进行灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液的标本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核酸提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活病毒。选用热灭活时可采用 95℃加热 15 分钟，不推荐采用 56℃孵育 30 分钟的处理方式灭活病毒，该条件不能保障充分灭活病毒。

　　污水水样标本处理可参考《污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》(WS/T 799-2022)推荐的方法；污水拭子标本处理可参考《农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范》(WS/T776-2021)推荐的方法。

　　③核酸提取。将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打开标本采集管加样，或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成后立即封盖。取适量核酸加至 PCR 扩增反应体系中。

　　④核酸扩增。将扩增体系放入荧光定量 PCR 仪，按照试剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按一般医疗废物转移出实验室处理。检测机构所选用的新冠病毒核酸检测试剂应针对新冠病毒基因组中开放读码框 1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)基因，人体标本检测原则上选择含内源性内参的核酸检测试剂。

　　⑤阳性标本的确认。实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：

　　条件一：同一份标本中新冠病毒 2 个靶标(ORF1ab、N)实时荧光 RT-PCR 检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新检测或重新采样复核。

　　条件二：两种标本实时荧光 RT-PCR 同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。

　　环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括：标本质量差；标本采集时间过早或过晚；标本保存、运输和处理不当；其他原因如病毒变异、PCR 抑制等。

　　⑥质控。由上级疾控部门对下级疾控实验室进行核酸检测质控考核，中国疾控中心每年至少开展一次对省级疾控机构实验室的质控考核，并同时提供全国新冠病毒实验室检测质控方案，省级针对地市级实验室的质控考核每年不少于两次。各检测机构应当加强核酸检测质量控制，选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。

　　性能验证。临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度(至少要有重复性)和最低检测限。室内质控。实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》(国卫办医函〔2020〕53 号)要求规范开展室内质控。每批检测至少有1 份弱阳性质控品(第三方质控品，通常为检出限的 1.5-3 倍)、3 份阴性质控品(生理盐水)。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。大规模人群筛查时，一旦出现阳性结果，应对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。

　　物品和环境标本的采集检测，还需在采样前及采样过程中至少设一个现场空白标本及一个运输空白标本，以进行过程中的质量控制。

　　室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构组织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，可适当增加室间质评频率。不按要求参加室间质评的，或室间质评结果不合格的，应通报批评并上报国家卫健委，待室间质评通过后方可开展核酸检测。

　　核酸检测实验室质控详细内容参见《国家卫生健康委办公厅关于加强疾控机构新冠病毒核酸检测实验室质量控制的通知》(国卫办疾控函〔2021〕548 号)《疾控机构新冠病毒核酸检测质量控制方案》。

　　2.病毒全基因组测序。病毒全基因组测序可以监测病毒基因组突变，为新冠病毒核酸检测试剂、疫苗研发策略的改变提供实验数据，同时也为流调溯源工作提供支持。

　　(1)测序标本选取原则。结合流调信息和病例传播链关系，优先选择以下标本开展测序：核酸检测 Ct 值≤32 的本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性标本、疫苗接种后核酸检测阳性者标本等。测序结果应与本地近一个月的输入病例和本土病例序列进行比对。

　　对同一传播链或流行病学关系明确的病例无需全部测序。

　　(2)测序要求。

　　①测序单位和流程。以省、自治区、直辖市为单位确定开展新冠病毒全基因组测序的机构，包括省级疾控机构和科研机构；具备测序条件的省份要在接收标本后24小时内开展测序工作。不具备测序条件的省份要及时将标本送至病毒病所，病毒病所收到标本后及时启动序列测定工作。

　　②结果报告与反馈。各省份要建立本省输入、本土病例新冠病毒基因组数据库，及时进行序列比对分析，逐步提高自主分析能力。获得的全部测序数据都必须上报中国疾控中心病毒病所用于我国新冠病毒溯源数据库的更新与维护。对本土疫情的指示或首发病例、本土疫情中由不同基因型的毒株导致的新传播链的指示或首发病例，测序完成后应于24小时内将数据报送病毒病所，病毒病所确认数据完整无误后于48小时之内反馈结果；对本土疫情中归属已知传播链的病例、境外输入病例、环境标本(非指示或首发病例相关)，测序数据于每周周一上午集中上报，病毒病所确认数据完整无误后于一周之内反馈结果。

　　3.血清抗体检测。血清抗体检测用作新冠病毒核酸检测的补充检测，也用于评估疫苗接种后诱发的免疫反应。应采用中国药品监督管理局批准的试剂进行检测，采集急性期(发病 7天内)和恢复期(3-4 周后)双份血清进行检测，也可根据临床需要确定采集时间，疑似新冠病毒感染者抗体检测阳性时应排除新冠疫苗接种因素的影响。

　　4.病毒分离培养。

　　(1)病毒分离培养对象。对核酸检测 Ct 值≤30 的所有境外输入病例的标本、本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例以及疫苗接种后核酸阳性者标本开展病毒分离培养。

　　(2)毒株报送与结果反馈。具有新冠病毒分离、培养资质的省级疾控机构应开展病毒分离培养工作，收到关键标本后96小时内开展相关工作，在获得分离毒株后96小时内将毒株送病毒病所保存备案，并将毒株序列等相关信息报送病毒病所。不具备病毒分离条件的省份，要在病例报告后48小时内启动送样流程，将标本送达病毒病所，病毒病所收到标本后应在96小时内启动病毒分离工作，获得毒株后96小时内反馈分析结果。

　　5.抗原检测。不具备开展核酸检测条件的基层医疗卫生机构、隔离观察人员和有抗原自我检测需求的社区居民可以进行抗原检测。抗原检测不作为确诊病例或无症状感染者诊断的依据，仅用作核酸检测方法的补充，实现“快筛快检”，提高感染者发现的及时性。具体实施流程及要求参照《新冠病毒抗原检测应用方案(试行)》(联防联控机制综发﹝2022﹞21号)执行。

　　三、实验室活动生物安全要求

　　根据新冠病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，该病毒按照第二类病原微生物进行管理，具体要求如下：

　　(一)实验活动规范。

　　新冠病毒培养、动物感染实验应当在生物安全三级及以上实验室开展；未经培养的感染性材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行，同时采用不低于生物安全三级实验室的个人防护；灭活材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行；不涉及感染性材料的操作，可以在生物安全一级实验室进行。

　　(二)相关标本处置。

　　各省级卫生健康行政部门要根据疫情防控需要和实验室生物安全有关要求，及时研判提出新冠病毒实验室检测生物标本处置意见。对确需保存的，应当尽快指定具备保存条件的机构按照相对集中原则进行保存，或送至国家级菌(毒)种保藏中心保藏；对无需保存的，由相关机构按照生物安全有关要求及时处理。

　　(三)实验室废弃物处理及实验室污染的处理。

　　参考《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》(试行第二版)