染色排除法鉴别细胞死活原理(如何通过眼组织推断死亡时间)

Posted 2023-05-29

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染色排除法鉴别细胞死活原理(如何通过眼组织推断死亡时间)

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断一直是法医学研究的重点内容，其有助于正确判断犯罪作案时间和及时布控侦查措施。有研究根据死后尸体变化如角膜混浊程度、尸僵形成与缓解情况、尸斑改变情况、尸温与环境温度等方面推断PMI，但其受影响的因素众多，PMI推断的结果相对准确度不高。20世纪60年代，研究开始利用眼组织推断PMI，发现随着死亡时间的延长，眼角膜、视网膜、玻璃体液及房水等均出现规律性的变化，并与死亡时间高度相关，可用于死亡时间推断。本文对其在法医学领域的研究进展作以综述。

1 眼角膜与PMI推断

长期以来，角膜混浊程度一直应用于法医学实践中早期PMI推断。个体死后角膜的形态学变化呈现一定的规律性，其混浊度在一定时间内会逐渐加重。通过肉眼观察，再结合主观经验可大致推断PMI。法医工作者根据个体死后角膜的混浊度（Turbidity of cornea, TC）变化来大致推断死亡时间，误差在12h左右，较大程度受主观印象影响[1]。

1.1 角膜清晰度与PMI的关系

存活状态下，角膜清晰主要依靠角膜内皮细胞膜的主动水转运功能和其与房水间的机械性屏障作用来维持。死后角膜内皮细胞会随时间延长凋亡，主动性水转运功能下降，机械性屏障作用消失，大量水分穿过角膜内皮层渗透到角膜基质层，造成角膜厚度逐渐增加而透明度下降 [2]。2010年，有研究基于角膜图像技术，发现角膜清晰度变化与PMI有较好相关性[3]。但该方法同时要求眼角膜始终暴露于空气中，尚不能用于实际案件检验。

1.2 角膜厚度与PMI的关系

1723年，Petit等[4]应用解剖学方法直接测量角膜厚度，认为死后尸体角膜组织水肿增厚，所测值大于正常值，且测量方法和人为因素对结果影响较大。随后有研究应用光镜测微尺测量死后不同时间点的角膜厚度，结果发现在一定时间范围内角膜厚度会随着PMI的延长而逐渐增加[5]。2008年，朱少华等[6]应用透射电镜和图像分析系统相结合的方法，发现角膜基质胶原纤维直径随PMI的延长逐渐增大，可作为PMI推断的一项指标。2012年，吕国丽等[7]应用超声法测量死后24h内角膜厚度变化情况，发现兔角膜上皮完整组角膜厚度的变化值与死亡时间呈非线性相关，且具有较强的相关性，解决了无损检测角膜厚度以推断死亡时间的难题。2013年，李晓娜等[8]用石蜡包埋切片染色的方法，结合图像分析软件研究了兔死后72h内角膜上皮层厚度、角膜基质层厚度与全角膜厚度变化规律，发现角膜基质层厚度和全角膜厚度均在死后12h~54h呈规律性增加，与PMI之间呈较好的线性关系。

1.3 角膜内皮细胞与PMI的关系

角膜内皮细胞结构比较单一，易于染色观察，同龄个体间角膜内皮细胞密度稳定，不可再生，无性别和种族差异，且位于角膜的最内层，受外界环境因素影响较小[9]。因此，许多学者以角膜内皮为实验对象，进行角膜内皮细胞活性率和角膜内皮细胞核DNA变化与PMI关系的研究。

20世纪90年代，宋国林等[10] 对死后24h内的已知PMI的500只非正常死亡者的眼角膜行茜素红-曲利苯兰联合染色，观察角膜内皮细胞活性率（endothelial cell living rate, ECLR）的变化情况，结果显示死后24h内ECLR与PMI存在着明显的负相关，可据此推断PMI。2014年李晓娜等[11]研究兔死后72h内角膜内皮细胞形态学变化与PMI的关系，结果发现ECLR下降趋势呈现先慢后快的特点，与PMI具有较好的相关性。因此，通过检测角膜内皮细胞的活性率为较好地推断PMI提供了一种可能。

由于角膜本身无血管，细胞排列规律，能避免不同细胞受管腔内溶解酶的影响不同，保持细胞核DNA降解的稳定性。刘承泉等[12]对家兔角膜上皮细胞和角膜内皮细胞进行DNA含量与PMI关系分析，发现家兔死后72h内角膜上皮细胞核和内皮细胞核DNA降解速率与PMI具有显著的相关性。2010年，郑吉龙等[13]应用单细胞凝胶电泳技术（single cell gel electrophoresis, SCGE），检测兔死后48h内角膜内皮细胞核DNA降解情况，发现兔角膜内皮细胞彗星样细胞出现率随死亡时间增加而逐渐增加。该技术可观察性较好，但可观察的参照指标较少，仍未能应用于实践。

1.4 角膜蛋白与PMI的关系

水通道蛋白1（Aquaporin-1, AQP1）属于水通道蛋白家族，其存在于角膜内皮细胞、基质细胞等多处部位，有研究表明其参与房水与角膜之间的水转运。基于个体死后AQP1逐渐降解的原理，有学者通过检测死后角膜水通道蛋白1(AQP1)含量的规律性变化以推断PMI，其结果的有效性和可靠性有待进一步观察[14]。

2 视网膜与PMI推断

由视网膜来推断PMI是近几年兴起的一个研究热点，视网膜位于眼组织的最内层，受外界环境因素的影响小。2007年，陈晓瑞等[15]应用复合荧光RT-PCR技术，发现大鼠死后28h内视网膜细胞β-actin、Pgk1和Rp14 等3个管家基因的mRNA含量随PMI的延长而下降，呈显著负相关。该法解决了检材含量低、敏感性不高、形态不易观察等难题，但只能对死后细胞mRNA降解作定量分析，不能检测mRNA动态变化。2009年，彭新等[16]使用改良Feulgen-Vans染色和图像分析技术检测大鼠死后28h内视网膜细胞核DNA含量变化情况，发现视网膜细胞核DNA与PMI亦具有良好的相关性。2010年，方超等[17]运用SCGE技术观察猪死后24h内眼视网膜细胞DNA降解规律，结果显示彗星头DNA含量随着PMI的延长而逐渐下降，这为探讨尸体眼球视网膜细胞核DNA降解规律推断PMI提供了初步实验参考数据。

3 玻璃体液与PMI推断

玻璃体液位于眼球内部，受眼眶保护，即使头部受到严重损伤，玻璃体液与血液、脑脊液相比，不易受影响。目前，用于推断PMI研究较多的有氨、尿素氮、肌酐、葡萄糖、无机盐离子（尤其是K+）、次黄嘌呤和酶类等。

3.1 玻璃体液中氨、尿素氮、肌酐、葡萄糖与PMI的关系

早在1978年，Oever[18] 发现猝死尸体玻璃体液中氨值会随着PMI的延长而规律性升高，同时死亡原因和环境温度也会影响氨值变化。1980年，Schoning等[19]研究不同环境温度下玻璃体液的生化成分变化与PMI的关系，发现环境温度在4℃温度下狗死后48h内玻璃体液中的肌酐和尿素氮随着PMI的延长而缓慢上升，但在较高的温度下稳定较差。1989年，Piette[20]肯定了测定死后玻璃体液中肌酐水平以推断PMI的可行性，并建议结合其他参数以准确推断PMI。1992年，Henke等[21]以新西兰大白兔为研究对象，结果显示死后4h和8h内血清和玻璃体液尿素氮浓度与PMI存在着明显的正相关。2006年，陶涛等[22]发现玻璃体液内葡萄糖浓度在死后迅速下降，死后24h左右为零。但该方法需排除引起血糖升高的因素，如糖尿病、寒冷天气、剧烈运动、含糖饮食等因素的影响。

3.2 玻璃体液中无机盐离子与PMI的关系

玻璃体液中包括多种无机盐离子，死后无机盐离子浓度变化规律是推断PMI的重要方法之一。死后由于睫状体的主动转运功能消失，会导致玻璃体液中钾离子含量升高。

1963年Sturner[23]通过检测54例尸体玻璃体液中钾离子浓度，首次建立了钾离子浓度与PMI关系的回归方程式。2002年龚志强等[24]在家兔死后96h内不同时间点检测了眼玻璃体液中多种金属元素的含量变化，结果显示钾离子、镁离子等13种元素含量与PMI显著相关。2010年耿文静[25]等运用全自动生化检测仪和超高效液相色谱分析仪进行检测，证实了玻璃体液中钾离子浓度可用于推断死后位于空气中的尸体PMI，而玻璃体液中钠离子和氯离子浓度变化可用于推断淡水中尸体PMI。由于研究中提取方法、取材位置、检测方法及左右眼等诸多实验方法和干扰因素的差异，学者们各自建立的回归方程式也会存在差异，这使研究结果的应用受到一定的限制。

3.3 玻璃体液中次黄嘌呤与PMI的关系

次黄嘌呤(Hx)的形成与机体缺氧状态有关，玻璃体液中Hx被认为是推断PMI的一项重要参数。1991年， Rognum等[26]用高效液相色谱法检测87例尸体玻璃体液中Hx浓度，发现Hx浓度随着PMI的延长而呈线性升高，呈显著的正相关，且其浓度变化受温度影响。和玻璃体中钾离子浓度变化相比，Hx浓度检测更适用于在生前无缺氧的尸检案例，尤其是死后24h内结果更可靠。2002年，Muñoz等[27]发现玻璃体液中Hx浓度在缢死中的含量增长速度远大于非缢死组，提示Hx浓度来判断死亡方式具有一定的研究意义。2010年，Muñoz [28]基于不同死亡方式下玻璃体液中K+、Hx和尿素（U）浓度变化建立了2个不同的回归方程式的软件，该软件推断PMI比以往的线性回归方程式结果更加准确。

3.4 玻璃体液中酶类与PMI的关系

2004年，李兴彪等[29]应用牛磺酸钠法对家兔进行急性胰腺炎造模并处死，检测兔死后不同时间点玻璃体液中淀粉酶浓度变化情况，发现兔死后72h内玻璃体液中淀粉酶浓度与PMI之间具有相关性。2005年，王伟平等[30]用光度法检测不同温度下家兔死后54h内玻璃体液中谷草转氨酶(GOT)和胆碱酯酶(CHE)的活性变化情况，结果显示在一定时间内这两种酶的活性会保持在一定的水平，而后会迅速下降，与PMI呈现显著的负相关。同年，刘承泉等[31]发现玻璃体液内羟丁酸脱氢酶(HBDH)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性变化与PMI之间存在显著的负相关。

3.5 玻璃体液物理特性与PMI的关系

2001年，龚志强等[32]发现家兔死后0～72h眼玻璃体液消光度与PMI呈线性正相关，可依此推断PMI。2008年，周睿卿等[33]首次将电导分析法应用于法医学PMI推断，发现 30℃和20℃下家兔死后玻璃体液电导率随着PMI的延长而持续升高，电导率变化与PMI之间存在着显著的正相关。

4 房水与PMI推断

房水与玻璃体液相比，呈水样流动性，易于抽取。其位于角膜后部、晶状体前部，在健康状态下不含有细胞成分，检测无机盐浓度受细胞干扰的可能性小。2010年，吕国丽等[34]用注射器抽取房水，并提取玻璃体液做对照，应用自动生化仪检测兔死后24h内眼房水钾离子浓度变化情况，发现利用房水钾离子浓度推断PMI可获得较好的准确度，房水比玻璃体液更适合PMI推断。但是由于房水量少且易渗透，在温度高的情况会加剧腐败与渗透，导致房水消失，故利用房水推断PMI只能适用于低温下或死后早期PMI推断[35]。

5 展望

尽管目前应用眼组织变化推断死亡时间的方法比较多，但是仍没有一种方法能安全、可靠、准确地应用于法医工作实践之中。如何建立一种可靠安全的PMI推断方法，则需要我们结合法医检案实践工作，利用眼球相对隔绝、受外界因素影响较小的优势，选择一个或者若干个相对稳定的观察指示参数，通过不断地进行造模排除比较大的干扰因素，拟定出系统规范化的观察标准，在后期动物实验研究的基础上，尝试进行人类尸体研究，从而使利用眼组织推断PMI的方法更趋近客观真实，期望成为一种用于法医学PMI推断的普遍适用的方法。