染色基本原理(染色法尿液有形成分分析系统的临床应用)

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篇首语:我们用人生最好的年华做抵押,去担保一个说出来都会被人嘲笑的梦想。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理,主要介绍了染色基本原理(染色法尿液有形成分分析系统的临床应用)相关的知识,希望对你有一定的参考价值。

染色基本原理(染色法尿液有形成分分析系统的临床应用)

作者:张时民

单位:北京协和医院检验科

尿液有形成分分析是尿液常规检验中的一项核心内容,而自动化尿液有形成分分析仪的出现也有20多年的历史了。除了进口品牌的流式尿液分析仪之外,还有众多的图像分析法仪器,也是国内外应用广泛的设备。如果将影像法仪器细致划分,还可分为流动型影像拍摄图像系统和静止型影像拍摄图像式尿液分析系统(图1)。

其实在静止型影像式尿液分析系统中还可细分为染色法和非染色法仪器,本文则以目前所了解的染色法尿液有形成分分析系统为主,介绍其检测原理及特点。据了解目前市场上主要有两个品牌的仪器在国内推广和应用,即日本东洋纺(TOYOBO)公司研发生产的UScanner检测系统和中国深圳美侨医疗科技有限公司研发生产检测系统。本文作者就手边掌握的资料着重就这两个检测系统进行介绍,给大家打开一个认识了解染色法尿液有形成分分析仪器的窗口。

影像法尿液有形成分分析系统在检验特点上主要是增加了一种染色剂,使得尿液中的有形成分以更加清晰、有特点的染色效果体现出来,使得在识别辨认上提高辨识度,当然也给计算机的运算和判定以及AI系统的应用提出了新的挑战。

一、USCANNER染色法尿液有形成分分析仪

是日本东洋纺公司生产的一款染色法尿液有形成分分析仪,并于2013年发布了USCANNERⅡ型仪器,在最近几年则有新一代的USCANNER(E)型仪器和USCANNER premio型仪器在国内外市场进行销售。

1.检测原理:系统构成包括自动进样系统、内置显微镜系统、数字相机,染色液容器和管路、清洗剂及管路、一次性计数池、图像分析软件和操作系统软件、废弃计数板暂存容器等。

系统独特之处在于对尿样本进行活体染色,即新鲜尿标本与染色液混合,快速染色如如图所示(图2)。仪器先将染色液滴加到在计数板上的一个小池内,再将混合均匀的尿液注入到这个小池中,混合染色,再吸取少许染色后的样本转移注入致计数板后面的计数池,经过一段时间沉淀,数字显微镜系统可以拍摄多幅彩色数字图像,软件系统可以对图像进行数字化分析,最终完成对图像中有形成分的鉴别和计数。

该仪器采用的方法独特之处是形态学原理及超活体染色法。一般图像法分析原理的仪器多会对有形成分的大小、边缘轮廓、纹理、细胞核有无、核大小、包浆和颗粒、投光性和色泽等诸多参数进行智能化分析。系统有独特的测量尺,可对有形成分大小进行实际测量。该设备以彩色图文的方式呈现最终检验结果。测定原理采用自主开发的程序,根据显微镜图像分析进行分类和测量.标本被注入到专用的一次性计数版(T-PLATE)后,在显微镜下进行聚焦,被拍摄成数码照片。软件可以搜索到有形成分并聚焦画面,通过软件技术分离有拍摄到的形成分的照片,通过图像处理后对图像的形态发现和背景进行分离,根据被分离出的有形成分的特征,如有大小、内部结构、细胞核、细胞质、染色、透明度等多种参数进行分析(图3),最后确定有形成分的属性并进行输出结果。分析结果可以选择不同的报告方法,可以选择每高倍视野(/HPF)或每微升(/μL)的方式,也可两者同时使用。

2.染色方法:设备采用具有专利的改良S染色法。标准S染色法(Sternheimer Stain)是尿液检验中常用的活体染色法,一般适用于人工染色与镜检。染液中包含两种物质,即阿利新蓝和派洛宁B。S染色是区别染色细胞质的优异方法,并且核以及核内结构清晰可见,观察未染色及染色,通过染色法可以区分难以识别的异形细胞(非典型细胞)。

改良S染色法为在原有配方的基础上增加了适合仪器操作运行,特别是染色时间上控制的改进,同时配合数字图像拍摄与识别效果,提高了尿液有形成分的辨识度。尿有形成分染色后可以明显观察到其内部细微结构,提高了尿液有形成分检测的阳性率,各个有形成分相互间不会造成干扰,误判率会降低。尤其可实现黑白图像法无法做到的对尿液肿瘤细胞或特殊异型细胞的辨别,对临床疾病的诊断辨别可提供更全面的检验结果。

3.可识成分:该设备在分析中有两种判别类型:①可自动识别的成分:红细胞、白细胞、上皮細胞、管型、細菌、結晶、酵母样真菌、精子;②细致分类的项目:上皮细胞(鳞状上皮细胞、尿路上皮细胞、肾小管上皮细胞);管型(透明管型、顆粒管型、蜡样管型)、红细胞形态学报告等。下图为该设备能够识别的尿液有形成分典型图案(图4)。该设备具有测量尺功能,在辨别有形成分时可以测量其大小,辅助鉴别不明成分。

4.染色法的其他优势:通过改良 S 染色法,还可区分活体白细胞与死体白细胞,而尿液中白细胞的死活可为临床提供尿路感染提供依据。染色法的一个特点是白细胞的活细胞往往不被染色液染色,而死亡的白细胞可被染色液染色。USCANNER(E)全自动尿有形成分分析仪应用改良 S 染色法进行分析时,也可自动区分尿液白细胞的死活,可有效作为女性急性尿路感染的诊断依据(图5)。此染色法还可发现疑似的尿路异型上皮细胞(图6),这不仅是尿沉渣检测仪器的一大进展,更重要的是得益于采用染色法原理的尿有形成分分析仪。

5.仪器其他性能参数:(1)检测速度:100样本/1小时。(2)样本量:样本用量112.5μL(但试管内尿液量至少1mL),染色液添加約37.5μL。(3)仪器屏幕上可提供多幅镜下染色的全视野彩色图像(图7),任意一幅图像都可放大查看。(4)配套试剂:染色液,每包装含600人份。(5)USCANNER专用清洗液,每包装5L。(6)配套质控品,QUSC‐700,USCANNER专用质量管理用品(5mL×6只)。(7)可以通过桥接方式与尿液干化学分析仪衔接,形成流水线系统。目前在日本是与西门子全自动尿液分析仪连接,形成检测流水线系统(图8)。

二、Mejer-1800染色法尿液有形成分分析仪

此款仪器是中国深圳市美侨医疗科技有限公司于2018年推出的一款染色法尿液有形成分分析仪器,有可能是国内最早生产静止型影像拍摄图像结合染色法的一款尿液分析仪器。该仪器首先使用SM染色法对样本进行染色,然后再采用高清像素彩色相机拍摄彩色图像,结合人工智能技术和深度学习技术,对尿液中的有形成分进行细致分析,将彩色图像和检测结果提供给用户。

1.检测原理:应用形态学、模式识别(SVM)、AI(人工智能)深度学习、色度学四种软件识别技术,对尿液中的有形成分进行细致分析和计数(图9)。因为采用视觉成像技术,在图像处理过程中对目标成分进行聚焦、对目标细胞坐标区域进行定位、目标区域分割、图像识别等,都是依据细胞图像轮廓、形态、色彩、纹理、平均灰度、圆形度、宽高比、平均投影、粗糙度、最大面积等诸多参数进行运算和处理。因为引入了染色技术,在图像识别中特别增加了色彩的分析与判别,为形态学分析增加一个变量。

2.处理分析管型的技术要点:(1)对拍摄的原始彩色尿沉渣图像采用色彩迁移法进行线性变换,降低不同样本间原始图像的背景色彩差异,最大化缩小同类别管型所含颜色的整体跨度,使同类别管型数据分布更加聚集;(2)采用形态学组合算法对色彩迁移后的图像进行管型分割,初步筛选后得到管型候选子图像;(3)对管型候选子图像做旋转、泊松融合等处理合成标准输入图像,并做归一化处理;(4)将归一化后的图像数据输入残差神经网络。

3.检测流程:(1)将样本混合均匀后,吸取一定量的标本。(2)取样针吸取标本后先将标本滴入专用染色板内进行染色。染色板是内含SM染色剂的盒装96孔染色板,每孔内含一定量的染色液,仅可对一个尿液样本进行SM染色。(3)标本染色后,取样针吸取一定量的标本,通过样本注入区充入到16孔的一次性计数版内(图10),排气孔用于排出板内气体,可使标本充板均匀,不产生气泡。该16孔计数板的独特处是一批次最多可充入16个样本。(4)将计数板自动推入到显微镜下,经过一定时间的自然沉淀,使得有形成分尽可能沉淀下来,沉淀时间越长则效果越好。(5)首先采用低倍镜扫描计数区,对较大目标(如上皮细胞,管型)进行拍摄、识别、分类和计数,对较小目标进行定位。如果尿液中有形成分浓度达到阈值后,仪器可运行自动稀释模式,重新充入计数板,再沉淀,以达到准确识别和计数的目的。(6)自动转换至高倍镜,对较小的定位目标进行拍摄、识别、分类和计数。

4.染色方法:该仪器采用经典的Sternheimer-Malbin(S-M)染色法,该染色方法在尿液检验中已经使用多年。尿液中的有形成分经两种染料染色后,使得其形态和内部结构清晰,特别是对白细胞、各类管型的识别更加易于识别辨认。该仪器所用的染色液是预先贮藏于专用的96孔染色板内,每板可进行96个尿液样本的染色检查(图11)。S-M染色液的主要成分为龙胆紫和沙黄,经过研究和改进,精心配置及过滤,适用于本自动化设备的染色应用。

尿有形成分的图像拍摄前先对尿液进行染色,整体染色前后对比效果较明显。由于尿沉渣中不同类别细胞自身的生理特性,染液中的色素会不同程度的附着在细胞表面,形成的轮廓边缘更加清晰,对比度更高。同时不同类别的细胞在色彩上也呈现出较大的差异,区分度更高。经过染色后整体图像对比度增强,细胞边缘更加清晰,提高了聚焦的精度和识别的准确度。

尿中主要有形成分染色特点如下:①白细胞:嗜中性粒细胞染成紫色,细胞核染紫红色(图12);②红细胞基本不着色或淡紫色(图13);③管型:透明管型染成淡红色或浅玫瑰色,颗粒管型染成淡紫色或者紫蓝色(图14),细胞管型染深紫色,蜡样管型染红紫色-深紫色;④上皮细胞:核染紫色-深紫色,胞质染桃红色-淡紫色,脂肪管型中的脂肪滴不着色;⑤细菌和真菌:存活及有活力的细菌染成粉红色,死亡的细菌染成深紫色,酵母样真菌不着色或淡紫色;⑥结晶不着色(图15)。

但是不同病人的尿液样本之间可因酸碱度、比重、颜色、粘稠度、细胞存活与死亡等多种因素影响,存在一定的差异,导致样本染色后的图像色差较大,不同尿液样本中同类别的细胞呈现出的颜色跨度过大,导致不同类别的细胞之间色彩交叉重叠变大,使后期模型分类器在训练时出现无法收敛,或者过拟合现象。为了解决该问题,在预处理中使用色彩迁移算法对原始彩色图像进行线性变换,降低了不同样本间图像的背景色彩差异,缩小了整体色彩跨度,使同类别的细胞数据分布更加聚集,相似度更高,提高了模型训练的收敛速度和分类精度。

5.可识别成分和图像特点:包括红细胞、白细胞、管型、上皮细胞、酵母菌、细菌、结晶、精子、粘液丝等39种尿液中的有形成分,部分有形成分和管型、结晶的亚类需人工辅助鉴别。可提供全视野图像(图16)及分割视野图像(图17)。可自由选择查看低倍、高倍镜下的全视野原图以及经过AI技术处理后分割并分类的单个细胞图片,具有单个图的追溯原图的功能,可追溯到这些细胞在原图中的位置和与周边的关系,进行对比和人工再判断,提高了复检的便宜性。

最近有文章对该仪器的性能进行了初步评价[1]:仪器法与显微镜法的对比,BLD阳性符合率为95%,WBC阳性符合率为97%;携带污染率,红细胞为0%,白细胞为0.01%;假阴性率红细胞为2.3%,白细胞为0.5%,管型为0.9%,符合行业标准<3%的基本要求;稳定性评价,8小时内开机稳定性CV<15%。

6.其他特点:(1)自动组合模式,可以同时桥接多台沉渣和尿干化学检验设备,解决沉渣测试速度比尿干化学慢的问题,实现大批量快速测试。(2)尿干化学+尿有形成分结果可以实现同屏审核,数据可经过LIS系统传输。可使用XX个/μl模式定量报告,可将尿干化学及有形成分以图文报告模式进行打印。(3)可增添尿红细胞直方图功能,使用深度学习+形态学,对异常形态的红细胞进行判别,提供红细胞形态学位相分析及异样红细胞比率参数;直方图可显示红细胞的直径分布宽度、平均直径、个数峰值比例、异常红细胞比例、异常红细胞个数等研究数据,这些内容有助于辅助判断血尿来源。(4)具有自动审核规则设置,实验室可将经实验研究后确认的审核规则输入系统,达到自动审核的目的,减少操作者工作强度,缩短TAT时间。(5)使用一次性计数板和染色板,减少交叉污染。一次性计数板设计独特,使用钢化玻璃面板,透光性强,平整度高,不会变形,有助于提高图像质量和清晰度。16孔设计的模式使得自然沉淀时间更加充分。(6)具有浓稠样本自动稀释功能,可自动利用染色板中剩余的样本进行 5 :1自动稀释重测,提升高浓度标本的检测精度和准确度。

7.性能参数:(1)样本量:最小样本量2ml,吸样量0.2ml。(2)检测速度:根据样本的复杂程度不同,其测试速度在90-150个标本/小时。(3)图像大小:采用高清彩色图像拍摄系统,实际图像分辨率2048×1536dpi。可拍摄多个全视野图像。(4)区域:全视野扫描,阴性过筛,确保样本不漏检;采集图像覆盖区域达20μl,纯图像采集区域3.5μl;使用图像计算区域2μl,检测范围宽,提高检测灵敏度和检出率;(5)配套耗材:①16孔一次性定量计数板;②盒装96孔染色板;③浓缩清洗液。

三、其他设备

目前有研发单位在开发血液及体液细胞的数字切片图像系统。所谓数字切片即是将血细胞或体液细胞涂在玻片上,应用高分辨率数字相机对玻片进行低倍镜,高倍镜和油镜下的全片扫描拍摄,形成一张完整的数字图像片(类似于病理切片),这种图像可以通过电脑软件系统查看,在网络系统的支持下,可以在各地同时共览,可用各种客户端查看,可逐级放大,获得清晰的细胞图像。

在血液检验和骨髓检验上,这种系统已经在使用,特别适合远程会诊、教学、考评和专题研究,在一些专题形态学讨论会上已有使用。但应用于尿液检验及体液检验的成熟设备还不多见。据了解某公司也在尝试开发用于尿液形态学分析的此类设备。首先将尿标本离心,用沉淀物染色、涂片、干燥,然后用该设备进行全片扫描,拍摄低倍镜、高倍镜和油镜下的图像。目前该系统对固定标本的染色片处理较好,但对无法固定的湿片,因有形成分经常移动位置,在全片扫描拍摄中还是有许多难度的。

审核及查看尿中的形态学发现,可通过网络对拍摄的图像进行查看,查看时首先观察全片(图19),选定一个区域后逐渐将目标放大,看清细胞结构、轮廓、细胞核,管型的细节等等(图20-21),还可使用内置的测量尺测量其大小(图22),协助对一些成分进行鉴别。目前虽然智能化识别判定只是仅仅开始,其识别判定能力会随着大数据的增加和推进,将取得不断的进展。

虽然该设备并没有投入到常规实验室的应用,但作者认为其在教学,培训,科研,实验室室间质评工作中具有广泛用途。尿液标本极难保存,而这些数字化的图像是可以永久保存的,实验室室间质评不再仅仅是给你几张图片进行考核,而可能是让你访问网站,给你一个ID地址或二维码,登录之后在给你指定的编号的标本图像中,查找和识别有形成分,并做出你的报告和判定。

总之尿液有形成分的数字化图像技术的应用,染色技术的应用,人工智能技术的应用将会不断被推进,将在临床检验、教育及质量管理等方面取得更多的进展。

参考文献

1.薛雄燕,李炜煊,彭超.Mejer全自动尿液分析流水线性能分析.临床普外科电子杂志.2020年第4期。

注:本文来源于《临床实验室》杂志2021年第4期“临床检验”专题

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