日本用酵母菌发酵有机肥(日本科学家构建新型酵母底盘，可高产酪氨酸及衍生物)

Posted 2023-05-28

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日本用酵母菌发酵有机肥(日本科学家构建新型酵母底盘，可高产酪氨酸及衍生物)

具有生物活性的植物芳香族次级代谢产物，例如二苯乙烯类、黄酮类和苄基异喹啉生物碱（BIA）在化工生产、食品、化妆品和制药等行业有广泛的商业应用。这类植物次级代谢产物是由 l-酪氨酸（ l- Tyr）生产的，因此也被称为酪氨酸衍生物。

目前这类芳香族化合物是通过植物提取来生产的，但植物中含量较少，且产量很大程度上取决于气候。近年来，合成生物学的出现推动了相关技术的发展。这些技术通过将植物来源的代谢途径引入底盘细胞，使其产生了目标化合物。其中，酵母作为化合物生产的“主力军”成为了首选，它们擅长合成植物衍生的化合物。

然而，酵母生产酪氨酸衍生化合物的潜力尚不清楚，因此构建具有高 l- Tyr 产率的酵母对于大规模生产各种芳香族化合物具有巨大的价值。

近日，日本神户大学的研究人员通过合理的改造，成功开发了一种具有高酪氨酸生产力的毕赤酵母菌株。并利用这种酪氨酸底盘细胞开发了智能细胞，可产生酪氨酸衍生化合物如白藜芦醇、柚皮素、去甲可乐林和网状菊碱。该研究成果以“ Construction of an l-Tyrosine Chassis in Pichia pastoris Enhances Aromatic Secondary Metabolite Production from Glycerol ”为题发表在 ACS Synthetic Biology 上。

（来源：ACS Synthetic Biology）

改造毕赤酵母使其高产酪氨酸及衍生物

在这项研究中，研究人员首先创建了一种可高产酪氨酸的毕赤酵母菌株 P. Pastoris，P. Pastoris 可在有氧条件下迅速繁殖，不产生发酵副产物如乙醇，因而它有可能在短时间内产生高产量的目标化合物。之后，以 P. Pastoris 这种新菌株为起点，改变其代谢途径，使其高产量地生产各种有用的化合物。

有业内人士表示，这项研究的难点在于目前没有关于在毕赤酵母中产生酪氨酸衍生化合物的研究报道，表达哪些基因可高产也未知。因此在对产生的酪氨酸量简单评估的同时，研究人员还寻找提高酪氨酸表达量的基因。

为了解决这个问题，研究人员着手在毕赤酵母菌株中寻找促进酪氨酸产量的基因。他们先选择了 betaanthin，betaanthin 是一种发绿色荧光的黄色颜料，因此，可通过观察荧光强度和颜色评估酪氨酸代谢通量的强度。betaanthin 可由酪氨酸经过三步反应产生。

▲图丨betaanthin 的生物合成途径和可从酪氨酸合成的有用化合物（来源：ACS Synthetic Biology）

在创建这种评估方法时，研究人员同样发现了可提高酪氨酸生产量的基因，并成功地开发了一种高产酪氨酸的毕赤酵母菌株。

▲图丨使用 betaxanthin 检测与增加酪氨酸生产力相关的基因（来源：ACS Synthetic Biology）

其次，研究人员通过改变高产菌株的新陈代谢来提高各种有用的酪氨酸衍生化合物的生产速度，并为每一种物质引入特定的生物合成途径，成功地提高了白藜芦醇、柚皮素和去甲克洛林的产量。

▲图丨毕赤酵母培养实验的结果（来源：ACS Synthetic Biology）

随后，研究人员对新型毕赤酵母的胞内代谢产物进行了综合分析，研究了酪氨酸高产的机制。发现在工程菌株中积累了大量的莽草酸途径代谢物，这些代谢物涉及酪氨酸和酪氨酸衍生物。这些结果表明，改变代谢通路成功地增强了酪氨酸的代谢通量。通过优化莽草酸途径的代谢，未来有可能进一步增加从酪氨酸生物合成有用化合物的产量。

▲图丨毕赤酵母细胞内代谢物的分析结果（来源：ACS Synthetic Biology）

研究人员的最终目标是以粗甘油为生长培养基发酵生产酪氨酸衍生化合物。通过使用粗甘油获得的液体（右图）作为生长培养基，他们成功地生产出与使用纯甘油时相同量的白藜芦醇、柚皮素和去甲克洛林。结果表明，毕赤酵母不仅可以从纯甘油中生产有用的化合物，而且还可以从粗甘油中生产有用的化合物。

▲图丨用作微生物生产原料的甘油（来源：ACS Synthetic Biology）

这项研究开发的新型酵母底盘可用于发酵生产各种有用的化合物和可以从酪氨酸生物合成的通用化学品。此外，研究人员希望通过利用新型毕赤酵母菌株的代谢组分析结果作为代谢途径优化的基础，进一步增加酪氨酸衍生化合物的产量。

“最终产业化仍需提高产物表达量和细胞鲁棒性”

这项研究的亮点首先在于开发了一个工业化的通用型毕赤酵母底盘细胞，使其可以合成一些植物来源的活性分子。目前一般将毕赤酵母用于小分子的合成，像一些植物来源的活性分子合成的报道仍然较少；其次，该毕赤酵母作为底盘细胞相较于酿酒酵母有独特的优势，如生长密度较高，且可以甘油为底物；甘油可以富集丙二酰辅酶 A ，丙二酰辅酶 A 是酪氨酸衍生物合成中很关键的前体分子。

上述业内人士表示，以毕赤酵母为底盘细胞高产酪氨酸衍生物仍有难点，难点在于酪氨酸衍生物会对毕赤酵母产生毒性。解决此难点有两种方式，其一，如何有效地增强毕赤酵母抵抗活性分子的能力；其二，如何通过优化代谢途径的方式，减少毒性中间产物的累积，实现通量平衡。

不过他也表示，该研究仍有不足之处。其一，若使用该底盘菌株产生野生产物，则野生产物的产量和产能需超过其替代植物的来源，而这需要进一步优化代谢工程和发酵工程，才具备产业化价值；其二，该底盘细胞应更具有鲁棒性，才能更好地去耐受有毒产物。

最后，作为多年研究毕赤酵母的科研工作者，他认为，酵母是一个较好的通用型底盘细胞，它介于原核细胞和高等真核细胞之间，因此，既具备原核细胞可快速分裂、生长快、培养方便、工艺简单和培养基价格低廉的优势，也具备真核细胞的一些功能性蛋白的翻译后修饰如磷酸化和糖基化等优势。而且培养动物细胞成本较高、周期很长且控制工艺体系较为复杂，从成本和产出角度考虑，也不适合应用于天然药物的生物制造。

除此之外，毕赤酵母在酵母类别中也比较特殊，它的糖基化相对更加温和，不会像酿酒酵母和霉菌等细胞出现过度糖基化问题，这将利用它中心表达的蛋白的活性发挥。而且毕赤酵母生长具有高密度的优势，也可提升未来的发展。