无蛋白CHO培养基(蛋白合成所采用的宿主细胞、筛选系统和基因工具介绍)

作者: 七七

在过去几年中，生物制药行业已转向由哺乳动物细胞表达系统进行生物制剂的生产。目前为止所有哺乳动物细胞表达系统中，CHO细胞应用最广泛，占据了70%的重组蛋白生产，且大多蛋白为单抗。本文对生产糖蛋白用的哺乳细胞细胞系进行了介绍，并概述了CHO细胞系的筛选系统和基因表达体系。

宿主细胞

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①中国仓鼠卵巢细胞(CHO)

CHO细胞广泛用于糖蛋白的生产，是由其众多的优点决定的，如蛋白生产速率高、适于大规模工业悬浮培养、可适应各种无血清和化学限定培养基。此外，CHO细胞生产的重组糖蛋白的糖链与人类本身的相似度高，其在人体内具有更好的兼容性和生物活性。另外，由于许多进入CHO细胞的病毒基因均不会表达，对于人类病毒感染CHO细胞表现出很强的抵抗性，从而可使蛋白被病毒感染的比率降至最低，因此可以降低生物安全风险。另外，在CHO细胞中还开发了不同的基因扩增系统，可获得较高的蛋白产量。近年来FDA和欧盟批准的单抗药物中，超过一半的都是由CHO细胞生产的。

虽然CHO细胞在糖蛋白生产中具有许多优点，但对于某些类型的人类蛋白糖基化其还不能催化表达，如α-2,6-唾液酸化和α-1,3/4-岩藻糖化。然而，对于一些人类不表达的糖基化CHO细胞却表达，如羟乙酸基神经氨酸(Neu5Gc)和半乳糖-α1,3-半乳糖(α-gal)，即使两者的含量都不会超过2%，但还可能存在免疫原性。即使通过代谢工程进行改善后，CHO细胞对于γ-羧酸类重组蛋白如凝血因子的生产还有一些限制。

②人类细胞系

有一种生产人源化糖蛋白的方法就是采用人类细胞系进行蛋白生产，可以担保的是，即使不是理想的糖蛋白类型，至少不会引起免疫反应。现阶段应用最多的分别是来自人胚胎肾脏和纤维肉瘤的HEK293和HT-1080细胞，Xigris就是由HEK293生产的，同时也是第一个由人类细胞系合成的被FDA和EMA批准的蛋白。在HT-1080细胞中也有四种蛋白(Agalsidase alfa, Epoetin delta, Idursulfase和Velaglucerase alfa)的生产获得FDA或EMA批准，虽然这些产品由于商业因素撤出市场。与HT-1080细胞生产的Velaglucerase alfa相比，CHO细胞的具有类似的糖基化表现，同时两者的体外活性、稳定性和效能都具有可比性。2014年使用人类细胞系生产治疗性的蛋白中有很多获得FDA或EMA批准，例如用于防止血友病A和B型流血发作的rFVIIIFc和rFIXFc。与CHO细胞系相比，在HEK293细胞系中表达的这些蛋白具有更高水平的酪氨酸硫酸化和谷氨酸γ羧化，并且不会存在Neu5Gc和α-gal糖基化。

现阶段一些人类细胞系还用于临床前研究和/或重组糖蛋白生产的临床开发阶段，如PER.C6细胞，这些细胞即使不用扩增相关基因也可得到高产量蛋白。MOR103和CL184都是由PER.C6生产的治疗蛋白，目前均已开展临床1/2研究。由HEK293S细胞和人类B细胞融合得到的HKB-11细胞，展现了高浓度的蛋白生产及α2,3和α2,6-唾液酸连接。另外两种细胞系，CAP和HuH-7细胞生产的蛋白目前正处于临床试验中，并且表现出与人类蛋白相似的糖基化水平。

③其他哺乳动物细胞系

幼年仓鼠肾细胞(BHK)常用于疫苗的生产，目前只有两种重组糖蛋白是用BHK细胞生产的，凝血因子VIIa和VIII。这些大分子蛋白由于其大量的糖基化和硫酸化水平，对于BHK细胞来说是很有挑战的。

鼠科骨髓瘤细胞(NS0和Sp2/0)，来源于不再合成本源免疫球蛋白的肿瘤细胞，也可用于生产商业用单抗如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕利珠单抗(Palivizumab)。2015年，FDA批准了三种由鼠细胞生产的单抗Dinutuximab、Necitumumab和Elotuzumab，分别用于治疗不同的癌症。另外，鼠细胞表达的Neu5Gc和α-gal糖基化水平比苍鼠细胞要高，因此会增加免疫原性的风险。

④非哺乳细胞细胞系和其他表达系统

虽然采用哺乳系统生产重组蛋白是近十年间的趋势，但是还有其他表达体系也可用于重组蛋白生产。由于这些生物细胞缺少所需的相关酶机制，不适合生产含有糖链的蛋白，因此其常用于不含糖基化的蛋白生产。细菌表达体系具有快速增殖、高表达蛋白的优势，然而蛋白往往会形成聚体，并且由于分子伴侣蛋白的缺失必须通过萃取才能获得。一些商业化的蛋白如天冬酰胺酶、胶原酶，其本身不含糖链，常用细菌表达体系生产。酵母表达体系具有细菌同样的优势，增殖速度快、蛋白表达高，但这些蛋白往往具有高甘露糖糖型，对人体可能具有免疫原性且疗效不高，例如奥克纤溶酶。

对于植物和昆虫细胞，两者都可以生产含有复杂糖基化的蛋白，但其类型结构与人类相差较大。事实上，植物表达以α1,3-果糖和β1,2-木糖为核心的糖链，完全与人类的不同，且可能会有免疫原性。昆虫细胞生产的N-糖型不是高甘露糖型就是寡甘糖糖型，植物和昆虫细胞的糖基化水平中都缺少唾液酸化。在植物和昆虫细胞中也有采用糖基化基因工程对其进行改造而生产蛋白的。2012年，FDA批准首个由植物细胞生产的治疗性重组蛋白taliglucerase alfa。在昆虫体系中批准通过的治疗性蛋白有人类乳头瘤病毒疫苗、前列腺癌疫苗和流感疫苗。最近，一些治疗性蛋白在转基因动物中也得到了。和其他哺乳动物表达系统一样，转基因动物表达蛋白的糖基化结构与人类也有些不同。市场中首个转基因动物生产的治疗蛋白是抗血栓药物重组人抗凝血酶Ⅲ，是从转基因羊奶中获得的。之后又有两种蛋白获批，分别是从转基因兔奶中得到的重组C1-Esterase抑制剂和转基因鸡蛋中得到的重组人源化溶酶体酸性脂肪酶。

细胞工程

在制药企业中，糖蛋白的生产在细胞的瞬转或稳转基因表达体系中都得到实现。当要求快速和经济时，瞬转表达依然是蛋白生产的首选，其跳过了冗长的筛选步骤，只需将含有目标基因的质粒导入细胞中便可，速度更快，更具效率。蛋白合成速率依赖于许多因素，如转染时的有效率、转染试剂的细胞毒性以及培养时的补料策略等，因此瞬转虽然没有稳转的蛋白表达水平高，但对于多数情况下瞬转更为有效。事实上，由于瞬转时的质粒是处于染色体外面的，细胞分裂时容易造成质粒丢失，进而限制了蛋白的产量。目前为止，通过病毒质粒进行的基因治疗主要还是由瞬转完成。当进行大规模的糖蛋白生产时，稳定的基因表达系统是更好的选择。为提高蛋白产量、工艺耐受性及减少细胞培养时间，在这些体系中已经做了多方面的努力及优化。

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①筛选系统

为提高蛋白合成速率及筛选效率，近年来发展了很多筛选系统。在稳定表达体系中，将目标cDNA整合在质粒时往往会再加入一段基因标记物，使其在筛选过程中带有一定的优势。质粒的拷贝数和整合到宿主基因中的位点是稳定基因表达系统中的关键因素。在生物制药中有两种常见的筛选标志，谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)和二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase，DHFR)。GS筛选系统最初是由Celltech (Lonza)开发的，通过由重组GS基因构建的谷氨酰胺营养缺陷互补株得到。由于NS0和Sp2/0只表达少量的内源性GS，因此只需将谷氨酰胺从培养基中移除便可满足筛选条件。而在CHO细胞系中，为增加GS筛选体系的筛选压力还需向培养基中添加蛋氨酸亚砜胺(methionine sulfoximine，MSX，谷氨酸类似物)，MSX可以抑制内源性谷氨酰胺活性。为增加此筛选系统的性能，Eli Lilly已经在CHO细胞系中开发出了谷氨酰胺合成酶基因敲除细胞系(KO)。同样，为建立DHFR筛选系统在CHO细胞中也构建了DHFR缺陷株。将重组DHFR基因整合到质粒中，将所构建的细胞株在不含核苷酸且DHFR酶活抑制剂(氨甲蝶呤)存在的培养基中进行培养，随着氨甲蝶呤的浓度培养，目标基因的拷贝数也在不断增加。除去上面提到的两个筛选系统，还有其他筛选系统如OSCAR，但目前为止只有DHFR和GS筛选系统被用于大规模生产中。

②基因表达

上面提到的筛选系统都可以达到我们的目的，但是其包含目标基因的质粒是随机的整合在宿主基因中的，这种随机的整合不仅会引起细胞群的不一致性，而且不同细胞株的蛋白表达量也会有很大区别。这种转基因很可能导入到异染色质区域，从而导致基因表达水平很低，而要从大量的细胞池中筛选出将质粒整合到核染色质区域的稀有细胞株将是一项繁冗的工作，因此合适的基因编辑工具将会大大增加效率。目前，已有多种分子和细胞生物工具针对特定的基因位点进行整合，这将帮助生物制药公司减少基因整合的随机性及对高表达细胞株的预测。虽然与随机整合策略相比，分离出高产稳定的细胞系需要更多的工作，但这依然是一个更具吸引的方法，因为其可以控制和预测子代克隆的表达水平。当目标基因与筛选标记物在同一质粒上整合到核染色质区域时，目标基因及标记物的表达增加的几率都会增加。

第一代基因工具，使用特异性重组酶靶向特定DNA位点进行敲除，有整合酶Cre/Lox和Flp/FRT。重组酶介导的盒式交换技术(RMCE)由于其可以这点靶向基因嵌入物而备受企业喜欢，RMCE利用重组酶对DNA不同识别位点突变体的识别差异，通过两次相对独立的重组反应产生一种交换的效果。RMCE技术提高了工业化稳定表达单抗的CHO细胞的构建成功率，缩短了细胞株构建时间。

第二代基因工具中，则采用的不同种类的内切酶，如锌指核糖核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9。这些内切酶可以诱导宿主DNA特定位点的双链断开，从而促进质粒通过非同源末端连接进行整合或同源的直接修复。ZFN和TALEN技术都能在核酸酶效应区域添加特定的DNA序列，因此其可以开发出一种具有高特异性及同源性的DNA重组序列。由于基因序列中包含众多的重复序列及高度同源DNA序列，为增加内切酶的特异性及减少脱靶效应，一种基于蛋白的基因编辑技术得以应用，CRISPR/Cas9。其是由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA组成的，并且是RNA引导的基因编辑，这项技术目前已在CHO细胞应用于减少不同克隆间的蛋白产量差异性。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术可用于指定基因的敲除，如GS和DHFR基因，ZFN便是其中应用最成功的技术之一。虽然这些技术在指定基因敲除中优势明显，但还是会有挑战，其一对宿主基因中的稳定及高表达热点的确认。还应注意的是，单次的基因敲除并不能解决所有的问题，对于某些蛋白还可能需要进行其他的质量调整，如折叠程度、糖基化，这些也可以基因编辑实现。

还有一些运用较少的基因工具，如哺乳动物人造染色体表达技术(ACE)。这种微型基因组在细胞内可以自我控制的进行表达，其基因序列可根据需要进行定制并表达，并且应用于CHO中也得到了可观的蛋白表达。在CHO细胞的补料分批培养中对ACE和随机质粒整合系统进行比较，发现细胞表现及稳定性都具有可比性。此外，转座子酶系统也可轻易的将目标基因导入到宿主基因中，如从鳞翅目昆虫中纯化得到的转座子酶PiggyBac，其已在CHO细胞中得到了提高产量的证据。

某些顺式作用表观遗传调控组件也可以用于提高细胞的产蛋白能力及稳定性，这些组件通过重塑核染色质环境可稳定目标基因转录活性。其中应用最多的一个顺式作用组件为MAR，为真核基因特有的顺式作用组件，由非组蛋白的纤维蛋白和大分子量的RNA组成三维网架体系。有研究表明，重组蛋白表达体系中存在MAR组件时可以明显提高表达水平，但也有学者指出MAR对序列具有要求，只有在特定序列中才会表现出作用。其他遗传调控组件还有UCOEs和STAR，已有研究运用UCOEs降低不同克隆间的表达差异性，关于STAR的应用还没有报道过。