摇床原理(小脑颗粒神经元的原代培养实验)

Posted 2023-05-27

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摇床原理(小脑颗粒神经元的原代培养实验)

简介

来源：《神经生物学实用实验技术》第四军医大学出版社

操作方法

原理

利用混合胶质细胞培养物分层生长，以及小胶质细胞半悬浮生长的原理，通过摇床震荡法，将皮层来源的混合胶质细胞培养物最上层的小胶质细胞震摇下来继续培养，达到分离和纯化小胶质细胞的目的。

材料与仪器

新生1-3d的仔鼠
含10%胎牛血清的DMEM培养基D-PBS液消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA) 37℃恒温摇床

步骤

1按照培养少突胶质细胞的方法，待10d后细胞分层生长。显微镜下可见满视野圆形、折光性强的小胶质细胞，附着在贴壁生长、紧密连接在一起、铺满培养瓶的星形胶质细胞层上面，甚至可见许多圆形小胶质细胞飘落在培养液中，此时可以开始纯化。

2.将培养瓶固定到37℃恒温摇床上，80-200r/min,振摇2h左右。

3收集振摇下来的小胶质细胞，种植到多聚赖氨酸包被的培养皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每2-3d换液1次。

4.小胶质细胞在体外较难进一步分裂增殖，但如果根据实验需要传代培养，一种方法可以直接用细胞刮子刮下细胞，接种到新的培养皿中；另一种方法就是用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后，进行传代。此方法获得的小胶质细胞，纯度可达90%-95%以上，可以用小胶质细胞特异性标志物F4/80、IBA1和IB4等进行免疫细胞化学染色进行鉴定。相差显微镜下观察，静息状态的小胶质细胞形态呈短小杆状或细长梭形等形态，带有2个或以上突起，折光性强，但是在激活和发挥吞噬功能状态下，小胶质细胞形态可发生巨大变化，胞体变大、变长或者变圆。

注意事项

1. 所有步骤要无菌操作．否则小胶质细胞有被污染或被微生物及毒素激活的可

2在振摇细胞之前，一定要确保底层的星形胶质细胞铺满培养瓶，并紧密连在一起，否则振摇过程中会将星形胶质细胞层摇起。

常见问题

1.振摇分离出小胶质细胞后，将新的培养液加入原培养瓶中继续培养，数天后又会出现大量的小胶质细胞，如此可以重复甚至更多次振摇收集小胶质细胞。

2.由于小胶质细胞数目所占比例较小，在体外较难分裂增殖，故其产最不高。有文献报道可以采用营养缺失法或加入单核细胞集落刺激因子(M-CSF)以增加产量。作者在培养过程中加入了15%-30%L929条件性培养基。L929是一种成纤维细胞系，由于其分泌M-CSF,结果可获得充足的小胶质细胞。