感受态细胞制备的注意事项(同样的protocol,为啥你做的感受态就是不行？)

Posted 2023-05-26

篇首语：惜时专心苦读是做学问的一个好方法。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了感受态细胞制备的注意事项(同样的protocol,为啥你做的感受态就是不行？)相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

感受态细胞制备的注意事项(同样的protocol,为啥你做的感受态就是不行？)

记得读研究生时，

实验室的规矩之一

就是新手要负责制备公用的感受态细胞，

即使有师兄师姐带着做，

结果仍然被鄙视。

心里不免产生一个疑问，

同样的protocol,

为啥我做的感受态就是不行？

作为新手的我们，

要想制备一款敏感却不脆弱的感受态，

得先了解

感受态细胞是什么

↓

理化方法诱导细胞，使其处于容易吸收外源DNA的生理状态，这种细胞即为感受态细胞。

感受态细胞制备的常用方法

目前制备感受态细胞常用的方法有RbCl (KCl)法、CaCl2法、电击感受态法等。其中，RbCl (KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用；CaCl2法简便易行，且转化效率完全可以满足一般实验要求，使用广泛；电击感受态法制备的感受态细胞转化效率高，操作简单，需要电击仪进行后续的转化工作。因此实验室感受态制备常用的两种方法就是CaCl2法和电击法。

实验室常用的有大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌感受态细胞，具体制备方法如下所示：

大肠杆菌感受态的制备（化转感受态）

1. 挑取宿主菌单菌落接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12 h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37 ℃振荡培养2-3 h至OD600在0.4-0.6之间。

2. 将培养液置于冰上放置30 min，然后于4 ℃下4000 r/min离心10 min，收菌。

3. 按3 mL菌液/1 mL的CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30 min后，4 ℃下4000 r/min离心5 min，弃去上清。

4. 加入700 μL的CaCl2轻轻悬浮细胞，加入300 μL的甘油混合均匀，即成感受态细胞悬液。

5. 感受态细胞分装成100 μL的小份，贮存于-80 ℃可保存半年。

毕赤酵母感受态的制备（电击感受态）

1. 从-80 ℃超低温冰箱中取出保存于甘油管中的毕赤酵母GS115或X-33，在YPD平板上划线，30 ℃恒温培养箱中培养 3天。

2. 挑取单菌落，接种在5 mL YPD液体培养基中，于28 ℃振荡培养18-24 h。

3. 取80-120 μL过夜培养物，接种到100 mL液体YPD培养基中，过夜生长至OD600 ＝1.15-1.5之间（最好是1.3），将细胞置4 ℃或冰上放置10 min。

4. 4 ℃下在2000 g离心5 min，收集细胞。加入100 mL冰冷的无菌水轻轻使菌体悬浮，再按上步离心。

5. 加入50 mL冰冷的无菌水悬浮清洗，两管合并到一管，再按上步离心，弃上清。

6. 细胞悬浮于40 mL 1 M冰冷的山梨醇，依上步离心后，再悬浮于20 mL 1 M冰冷的山梨醇，按上步离心，去上清。

7. 用大约100-200 μL的1 M冰冷的山梨醇重悬细胞，使细胞终浓度达到1×1010 cells/mL，放置在冰上备用（仅当天使用）（一般先加100 μL重悬，若细胞比较粘稠吸附不起来，再适当加50-100 μL）。

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备

1. 挑取宿主菌接种于3 mL 液体培养基中，37℃摇床培养过夜。

2. 从过夜培养物中取100 µL菌液，接种至用50 mL 离心管配好的5 mL SPI Medium中，37℃摇床培养，3 h后开始测OD600，当培养物生长到对数末期时约4.5 h，快速取200 µL接种到2 mL SP II Medium中，于37℃ 100 rpm摇床培养1.5 h。

3. 加20 µL 100×EGTA溶液，于37℃ 100 rpm摇床培养10 min，用1.5 mL离心管分装成500 µL每管。

4. 向管中加入适量的质粒，轻轻混匀于37℃ 100 rpm摇床培养30 min。

5. 将离心管转移到250 rpm摇床，37℃培养1.5 h。

6. 以4000 rpm离心收集菌体，弃部分上清液，留100 µL重悬菌体，涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。

地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备

1. 挑取宿主菌单菌落至10 mL枯草芽孢杆菌基本培养基中，37℃ 剧烈振荡培养16~18 h，250 r/min，培养至OD600为1.0。

2. 取1.5 mL该培养液加入到10 mL 37℃ 水浴预热的40 mL新鲜枯草芽孢杆菌基本培养基中，37℃剧烈振荡培养4 h，250 r/min。

3. 加入 10 mL芽孢杆菌饥饿培养基，37℃剧烈振荡培养4 h，250 r/min。

4. 将细菌在冰水浴冷却15 min，分装于0.5 mL Eppendorf 管中，于4℃ 10000 r/min 离心10 min，用预冷的水轻轻溶解悬浮，可直接进行实验，也可于-80℃冻存。

看起来protocol都很简单，

但制备的感受态效果却千差万别，

原因可能就是你没有注意到一些实验细节。

↓

注意事项

细胞生长状态和密度：细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过检测培养液的OD600来控制，如DH5α菌株的细胞密度在5×107个/mL左右就比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

实验操作时要格外小心：悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化效率。

制备好的感受态最好一次分装后快速冷冻于-80℃，反复冻融会极大地影响转化效率。

从离心机拿出离心管时应立即插入冰中，再拿到超净台，操作时不要用手触摸管底的菌体沉淀并保持无菌操作。

离心机和离心管要提前半小时预冷。

整个制备过程不要染菌，制备结束后，可在相应的平板上涂一支感受态细胞，检测其是否染菌。

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