急性毒性替代试验有哪(好动保凭安全性说话应激宁小鼠急性毒性试验及亚慢性毒性试验)

Posted 2023-05-26

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急性毒性替代试验有哪(好动保凭安全性说话应激宁小鼠急性毒性试验及亚慢性毒性试验)

应激宁具有保护鱼体肝脏，解除机体内有毒物质，促进机体正常代谢，提高鱼体抗应激能力的作用。为评价应激宁的安全性，根据农业部“兽药临床前毒理学评价试验指导原则”技术要求，对应激宁进行小鼠的经口急性毒性试验和大鼠亚慢性毒性试验。

1 材料方法

1.1 受试药物

应激宁，批号：20210125。由武汉华扬动物药业有限责任公司提供；羧甲基纤维素钠，国药试剂。

1.2 试验动物

清洁级ICR小鼠，雌雄各半，体重18～22g，购于扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号：SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号：SYXK（苏）2012-0029。小鼠饲料由该中心提供，自由采食和饮水，试验前在实验动物房适应3天，试验给药前停食12 h，不限制饮水。

6周龄清洁级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重公鼠在130~150g之间，母鼠在120~140g之间，由扬州大学比较医学中心提供。动物生产许可证号：SCXK（苏）2012-0004，使用许可证号：SYXK（苏）2012-0029。

1.3 试药准备

精确称取试药12.5g，加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液50ml，配制成0.25g/ml的混悬液备用。

1.4 急性毒性试验

1.4.1 方法

取8只小鼠（雌、雄各半）分为两组，每组4只，每组设2个重复，禁食12h 后，取上述混悬药液，灌胃给药1次，灌胃给药体积2ml/100g（相当于原生药5000mg/Kg）。给药后4 h内连续观察，之后每天上午和下午分别由试验人员肉眼各观察1次，连续观察7 d。

1.4.2 评价指标

小鼠存活率，精神状况、采食量、饮水量、排便。

1.5 最大耐受性试验

按照农业部兽药评审中心《兽药研究技术指导原则汇编》之兽药急性毒性试验指导原则精神，将动物数增至10只，并重复2次试验。即又取20只小鼠（雌雄各半），再次进行灌胃给药1次，灌胃给药体积2ml/100g，给药后4h内连续观察，之后每天上下午各观察1次，连续观察7d，结果小鼠全部存活，即受试药物应激宁的LD50大于5000mg/Kg，提示该受试物毒性很低，依据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》（国家食品药品监督管理局编．中药、天然药物急性毒性试验技术指导原则GPT2-1[S]．2005．）改用最大耐受量给药试验。

1.5.1 方法

ICR小鼠40只，随机分成2组，即阴性对照组和染毒组（试验组），每组20只，雌雄各半，试验前禁食不禁水12h。染毒组小鼠按2ml/100g BW灌胃试药混悬液，间隔3h后重复灌胃给予等体积试药；阴性对照组灌胃给予等容积0.5%羧甲基纤维素钠溶液，给药后4h 内连续观察，之后每天上午和下午分别由试验人员肉眼各观察1次，连续观察7d。

1.5.2 评价指标

观察动物精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食、二便、口鼻分泌物等一般状态，并详细记录动物的中毒表现和特点，毒性反应出现和消失的时间、死亡时间，观察期结束后将所有存活小鼠脱臼处死，进行眼观病理学检查。

1.6 亚慢性毒性试验

1.6.1 给药剂量及分组

将80只Wistar大鼠随机分为4组，分别为应激宁高、中、低剂量组和空白对照组，每组20只，雌雄各半。组内动物个体体重相差应不超过平均体重的20%，组间平均体重相差不超过5%。

由于急毒试验没有测出LD50，90天喂养试验的高剂量组按最大耐受剂量10g/kg，混饲给药，分为低，中，高剂量组及对照组。给药各组剂量分别定为：0.0g/kgBW，2.5g/kgBW，5.0g/kgBW，10g/kgBW，连续给药90天。

1.6.2 检测项目与方法

服药期间每天肉眼观察大鼠的一般行为（包括精神状态，行为活动，采食量，饮水量，毛色，对外反应，粪便等）、中毒及死亡情况；同时记录饮水量、采食量，并按周测量大鼠体重，投入饲料量和剩余饲料量。并计算平均摄食量、增重。将染毒剂量组与对照组加以比较和统计学处理，及时记录和分析大鼠的中毒症状及出现各症状的先后次序、时间。

1.6.2.1 血液学和血液生化检测

在给药45天和90天结束时，各组随机抽取10只大鼠（雌、雄各半）采血进行血液学指标检测（包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数和分类等）和血液生化指标检测（包括谷草转氨酶（AST或SGOT）、谷丙转氨酶（ALT或SGPT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLu）、血清白蛋白（Alb）、总蛋白（TP）、总胆固醇（TCH）和甘油三脂（TG）等）。

1.6.2.2 病理检查

（1）大体剖检

于给药45天和90天试验结束，各组分别取10只大鼠（雌、雄各半）进行剖检。

剖检试验大鼠的同时，称取大鼠体重及各主要脏器（包括肝、肺、心、肾、脾、胃肠、睾丸/子宫等）重量，计算各脏器系数。

（2）脏器称重

剖检试验大鼠的同时，称取大鼠体重及各主要脏器（包括肝、肺、心、肾、脾、胃肠、睾丸/子宫等）重量，计算各脏器系数。

1.6.2.3 数据处理

数据以x±SD表示，用SPSS应用软件进行组间数据的显著性检验。采用t检验比较试验组与对照组间的平均饲料摄入量、饮水量、增重和增重率、血液学和血液生化学等各项指标的显著性差异。

2 结果

2.1 急性毒性试验及耐受性

染毒组ICR小鼠在2次按照给予2ml/100g BW的试药混悬液，即10g/kg剂量经口染毒后的4h内，与阴性对照组小鼠相似，所有小鼠均存活，且精神、自主活动、采食、饮水、排便等正常，未出现中毒反应，便停止重复给药。7d观察期结束，所有小鼠均存活，之后采用颈椎脱臼处死存活小鼠，眼观病理学检查均未发现明显的病理变化。结果表明，应激宁小鼠经口染毒，LD50大于5.0g/kg；最大耐受量大于10.0 g/kg。

2.2 慢性毒性试验

2.2.1 临床表现

各组大鼠拌饲给药直至90 d，均无死亡，期间精神、活动，采食行为、饮水行为、毛色、对外反应和粪便等临床表现正常，没有出现病理状态和死亡。

2.2.2对大鼠体重的影响

试验期间，每周对各组大鼠称重1次，统计周平均体重和周增重率。结果第1周高剂量组母鼠的周均增重率显著低于空白对照组（P<0.05），其余各周各给药组母鼠的均重和周均增重率与空白对照组均无显著差异；第1～7周各给药组公鼠的均重都显著低于空白对照组（P<0.05），第8～12周部分给药组公鼠的均重仍显著低于空白对照组（P<0.05），但各给药组公鼠的周均增重率只有第1、2周显著低于空白对照组（P<0.05），而第3周后各给药组公鼠的周均增重率与空白对照组均无显著差异，甚至有许多周还高于空白对照组的周均增重率，详细结果见表1。

引起这现象的原因是由于给各药组所给药物应激宁分别达到了饲料含量的2.5%、5.0%和10.0%（指导原则要求高剂量组应为靶动物摄入量的100倍），从而一定程度上降低了饲料的能量、蛋白质和其他营养物质的含量和影响了适口性，因而造成饲料摄入量应该较多的公鼠在给药早期（第1、2周）采食量相对减少，体重增加亦较少。

另外，从整个给药试验的前45d、后45d及90d的周均增重率来比较，所有试验给药的高、中、低剂量公、母鼠各组与空白对照组均无显著差异，说明在大鼠适应含药饲料后，应激宁对大鼠体增重没有大的影响。

试验结束时，各试验组公鼠的平均体重均比空白对照组低近30g，因为各组内标准差比较大，只有中剂量组的均重显著低于空白组（P<0.05），低剂量组和高剂量组与空白组差异不显著。造成体重差异的原因，还是与各试验组公鼠的采食量比空白组低有关，整个试验期间空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组采食量分别为1271.69g、1124.76g、1153.04g、1199g，低剂量组的采食量最低，比空白组低近147g，同时添加中药后饲料的能量和蛋白质含量相应降低，导致各试验组大鼠试验结束后体重比空白组低很多；因为添加更多的中药中剂量组和高剂量组饲料的能量和蛋白质比低剂量组的更低，但是这两组的采食量比低剂量的高、高剂量组的采食量比中剂量组的高，所以这三组的增重比较接近。

表1 对大鼠体重的影响

注：同行数据上标字母不同且相邻者差异显著（P<0.05），相间者差异极显著（P<0.01）。下类同。

2.2.3对大鼠采食量和饮水量的影响

试验期间对各组大鼠的采食量和饮水量进行统计分析，结果显示：除第1周各给药组公鼠的采食量显著低于空白对照组（P<0.05，这与大鼠对含药饲料的适应性有关），各给药组母鼠的采食量略低于空白对照组外，其余各周各给药组公母鼠的采食量和饮水量与空白对照组相比均无显著差异（P＞0.05），详细结果见表2。说明在大鼠适应含药饲料后，应激宁对大鼠的采食量和饮水量没有明显影响。

表2 对大鼠采食量、饮水量的影响

2.2.4对大鼠血常规和血液生化指标的影响

连续给药45d和90d后，对各组一半大鼠的血液学指标和血液生化指标分别进行了检测统计分析，结果显示：各剂量组的血液学指标和血液生化指标测定值与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05），详细结果见表3、表4。说明应激宁按高、中、低剂量混饲连续给药90d，对大鼠血常规和血液生化指标未造成影响。

表3 连续投喂45 d对Wistar大鼠血液学及血液生化参数的影响

表4 连续投喂90 d对Wistar大鼠血液学及血液生化参数的影响

2.2.5对大鼠主要脏器系数的影响

连续给药45d和90d后，各组分别取一半大鼠扑杀，剖检观察、称量主要脏器，统计分析各脏器系数。结果显示：所有给药组的各器官脏器系数与空白对照组相比均无显著差异（P＞0.05），详细结果见表5。说明应激宁按高、中、低剂量混饲连续给药90d，对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、睾丸/卵巢子宫的生长发育均没有影响。

表5 对大鼠主要脏器系数的影响

3 结论

根据WTO有关外源性药物急性毒性分级标准进行评价，试验结果表明应激宁属实际无毒。在试验条件下，未发现应激宁对大鼠的生长发育产生不良影响，90d连续给药无亚慢性毒性。体重的差异与采食量和摄入的能量及营养物质含量下降有关。