怎么判断立体异构体的数目(论蛋白质组全片段的配体和靶标该如何发现)

Posted 2023-05-26

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怎么判断立体异构体的数目(论蛋白质组全片段的配体和靶标该如何发现)

文|煮酒

图|煮酒

基因组测序和编辑方法的重大突破极大地扩展了我们对人类疾病的分子理解，并对蛋白质功能产生了无与伦比的洞察力。然而，在许多情况下，从人类遗传学中获得的知识尚未转化为新药。这部分是由于鉴定了与疾病相关的基因，这些基因编码了传统上被认为是“难以药物”的蛋白质，例如衔接蛋白和转录因子。在其他情况下，蛋白质对传统的小分子筛选方法难以抗衡，或者具有完全未表征的功能，这使得潜在化学探针的鉴定成为一项挑战。

近年来，出现了强大的化学蛋白质组学（“化学组学”）方法，能够在全球范围内直接在天然生物系统中发现蛋白质的配体。

这些方法通常使用由以下部分组成的化学探针：

1.促进与蛋白质组中蛋白质亚群相互作用的识别组。

2.用于共价捕获相互作用蛋白质的反应性基团。

3.报告组（荧光团，生物素或支持电击化学的手柄），用于检测，富集和鉴定或可视化相互作用的蛋白质。

这些特性赋予了支持化学的探针直接在天然环境（如活细胞）中捕获探针-蛋白质相互作用的能力，从而保留了使用传统体外技术可能错过的不稳定相互作用。此外，此类探针可以富集和鉴定低丰度/低亲和力相互作用的蛋白质以及在其检测中经常存在技术挑战的其他蛋白质（例如膜蛋白）。在现代使用中，这些平台使用广泛的化学探针来报告整个蛋白质组中共价或非共价配体的结合位点占有率。为了在全球范围内绘制配体蛋白图谱，最近的化学病理学研究已经部署了基于片段的化合物的小型文库（。与传统的基于片段的配体发现（FBLD）筛选方法类似，这些文库能够有效地探索化学空间，同时为先导物开发提供潜在的命中化合物。在这里，我们讨论了这些基于片段的策略的发展，并重点介绍了它们在扩展配体蛋白质组感知边界方面的应用。

化学蛋白质组学分析与基于片段配体发现的整合

与传统的高通量筛选方法相比，ABPP和相关化学疗法可以直接在天然生物系统中对数百至数千种内源性蛋白质的化学文库进行平行筛选。在此过程中，化学配体和靶标发现方法在全球范围内评估蛋白质对小分子的可追踪性，同时也促进了可制成选择性化学探针的配体的开发。然而，这种方法的一个主要缺点是基于质谱（MS）的工作流程的通量有限，限制了可以在蛋白质组范围内评估的文库成员的数量。因此，最近基于片段的配体发现（FBLD）与化学蛋白质组学方法的整合使得能够使用相对较小的化学库对配体蛋白质进行全球定位。

与大多数HTS中使用的化学文库不同，FBLD通常涉及分析较小的低分子量（<1000 Da）化合物（约300）文库，即片段，以与纯化的蛋白质靶标结合。通过设置低分子量限值，与用于HTS的传统分子量截止值相比，FBLD将原子组合的总可能数量减少了数十个数量级。

58因此，片段筛选能够使用更小、更简化的化合物库探索更大比例的化学空间，与 HTS 命中相比，这些化合物库往往具有更高的配体效率。片段筛选往往比HTS具有更高的命中率，但是，由于这些命中的低亲和力，FBLD仅限于纯化的蛋白质靶标的研究，其中配体 - 蛋白质相互作用通过生物物理方法（如NMR和X射线晶体学）表征。然而，通过将片段附加到可光活化或亲电反应性基团中，可以使用化学化学工作流程捕获和处理低亲和力片段-蛋白质相互作用。在以下部分中，我们将讨论这种综合方法在共价和非共价配体-蛋白质相互作用的全球鉴定中的应用。

共价配体性映射

共价配体是化学探针开发的有吸引力的起点，因为与非共价配体相比，它们有可能提高浅结合口袋的效力并增加驻留时间。部分由于强大的化学方法（如ABPP）的出现，以检测蛋白质组范围的共价相互作用，学术界和制药行业对共价化合物的开发越来越感兴趣，最近FDA批准了几种共价药物，如伊布替尼（布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂）和索托拉西布（KRAS）。G12C抑制剂）。最早的共价片段筛选方法之一是将含二硫化物的片段库与含有天然半胱氨酸或重组引入的半胱氨酸的纯化蛋白在结合位点内孵育，从而与目标半胱氨酸进行二硫醚交换，并选择在其附近可逆稳定的片段。

共价FBLD与定量蛋白质组学相结合，能够对细胞裂解物中的半胱氨酸反应性片段进行蛋白质组范围的筛选。使用广泛反应性的碘乙酰胺炔烃探针报告半胱氨酸的占用情况，使用竞争性isoTOP-ABPP在整个蛋白质组范围内筛选了约60个不同亲电片段的小型文库，从而在750多种蛋白质中鉴定了620多种配体半胱氨酸，包括难以给药的靶标，如转录因子和支架蛋白。在这里，使用所谓的“侦察”片段可以对相对较小的库进行配体半胱氨酸残基的广泛调查。至关重要的是，这项研究表明，在蛋白质组范围内对脱靶反应性进行评估的指导下，将这种侦察片段合成成更高分子量的化合物，促进了更具选择性的化学探针的开发。例如，化学指导的配体优化工作导致了促CASP8选择性共价抑制剂的开发。

在随后的研究中，研究了具有共价侦察兵片段的KEAP-1突变非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的半胱氨酸反应性差异，从而绘制了156个可配体半胱氨酸的映射，其反应性由NRF2调节。这一发现导致了一种共价配体的发展，该配体靶向这些半胱氨酸之一，非典型孤儿核受体NR274B0的C1，导致多聚体蛋白复合物的破坏，随后抑制KEAP1突变癌细胞的锚定非依赖性生长。在类似的研究中，使用反应性侦察兵片段来广泛鉴定半胱氨酸配体性的变化作为人类T细胞活化的功能。

在这里，总共鉴定了约16000个反应性半胱氨酸，并且发现∼，400种蛋白质中的约2200个半胱氨酸可与侦察片段配体，并跨越不同的免疫功能和蛋白质类别。值得注意的是，发现160种蛋白质含有半胱氨酸，其反应性因T细胞活化而改变，其中许多蛋白质也可与共价片段配体，突出了在特定免疫相关条件下为这些靶标开发共价化学探针的潜力。除了作为进一步优化的先导物的侦察片段外，它们还可以提供特定结合位点的化学可处理性的证据，以支持更大、更精细化合物的靶向筛选。为此，在Kavanagh等人最近的一项研究中，发现位于JAK817的非催化假激酶结构域中的C1可与亲电侦察片段配体。

作者随后使用更大的结构复杂亲电试剂库进行基于MS的靶向筛选，导致发现一种针对该变构位点的高度选择性化合物，从而阻断JAK1依赖性细胞因子信号传导。这些结果强调了片段在鉴定蛋白质上新的可药物结合位点的效用，即使它们本身不能作为进一步优化的先导物。

非共价配体性映射

并非所有蛋白质上的配体位点都具有可被亲电反应性基团靶向的亲核残基，因此需要替代化学疗法策略来广泛评估非共价配体性。几十年来，鉴定非共价小分子-蛋白质相互作用的经典方法（如亲和色谱）一直用于鉴定生物活性化合物的靶蛋白。虽然亲和纯化非常适合鉴定丰度和高亲和力靶标，但此类方法不适用于低亲和力相互作用（例如片段）和低丰度蛋白质靶标。光亲和标记提供了一种实用的解决方案，因为它允许在紫外线照射下共价捕获探针和蛋白质之间的瞬时可逆相互作用。虽然光亲和探针的应用可以追溯到1960年代初，70大多数专注于生物活性化合物的改造，例如药物，天然产物，代谢物或表型筛选命中，并带有光亲和标记，以识别负责其观察到的生物学的潜在蛋白质靶标。

为了广泛鉴定配体蛋白，独立于反应性残基的存在，配备光亲和富集手柄的专用小分子片段已与ABPP方法集成，用于非共价配体-蛋白质相互作用的全球映射。在这种方法的第一个示例中，一个包含12个全功能片段探针的文库，这些探针是附加到由炔烃和光活化二嗪啶组成的检索标签上的小分子片段，导致直接在活细胞中鉴定了2，000多种配体蛋白。探针显示蛋白质组范围的结合偏好，并且证明它们可以通过鉴定探针修饰的胰蛋白酶肽直接在活细胞中绘制蛋白上的结合位点。

进一步表明，这些广泛的片段相互作用谱可以推进到调节蛋白质功能的选择性非共价配体中。例如，在比较分析研究中鉴定的导体侦察兵片段被用作活细胞竞争性分析实验中的结合位点报告探针，以开发代谢酶PTGR2和线粒体酰基肉碱转运蛋白SLC25A20的抑制剂。最近，我们应用这种方法开发了SLC15A4的一流功能抑制剂，SLC12A7是一种对TLR9-<>和NOD信号传导至关重要的内溶酶体<>跨膜转运蛋白。鉴于SLC15A4如何调节TLR信号传导的分子细节尚不清楚，因此开发了一种识别结合剂的综合方法，该结合剂也可以直接破坏原代人免疫细胞中的内溶酶体信号传导。

在化学指导的优化后，显示先导化合物抑制SLC15A4介导的炎症细胞因子在多种免疫模型系统中的产生，包括狼疮患者免疫细胞和体内。这项研究强调了这种平台的价值，可以直接在可翻译的模型系统中以机械不可知的方式识别具有挑战性的蛋白质靶标的小分子调节剂。为了加速光活化片段文库的筛选，这种FFF方法最近已被应用于基于靶标的结合测定，使用重组纯化的蛋白质来鉴定KRAS等靶标的配体G12D和 BCL6。

支持化学组学的片段样文库的表型筛选

尽管侦察片段的广泛分析为配体蛋白和结合位点的潜在可追踪性提供了有价值的见解，但将简单的支架发展为更先进的化学探针可能会被初始命中的低亲和力和混杂性所混淆，可能需要更多的劳动密集型优化。因此，在另一种方法中，化学疗法可以与表型筛选相结合，以确定生物活性亲电试剂的靶标。表型筛选与支持化学组学的文库的耦合不仅提供了发现调节潜在治疗可翻译功能结果的化合物的机会，而且还提供了直接识别药理学上负责靶标的能力，而无需使用亲和手柄衍生化命中化合物以进行靶标鉴定。

也许这种方法的第一个例子是筛选一个精心制作的（分子识别组的中位数MW）全功能化片段文库，以鉴定促进脂肪生成的化合物。对顶级命中（CPAG-1）的化学蛋白质组学研究导致确定相对未表征的PGRMC2作为主要靶标。随后发现CPAG-1是功能获得配体，PGRMC2是血红素的分子伴侣，对脂肪细胞功能至关重要。

最近的研究还表明，结构简单的亲电化合物可用于表型筛选，并与ABPP偶联以进行即时靶标鉴定。例如，RTN4被发现是一种结构简单的丙烯酰胺的靶标，可阻止结直肠癌的生长。此外，在半胱氨酸和赖氨酸反应性亲电试剂的表型筛选中，以鉴定激活自噬的化合物，发现铅命中靶向vATP酶ATP277V6A催化亚基中的C1，从而抑制mTORC1信号传导并提高TDP-43聚集体的清除率。最近，为了鉴定调节T细胞功能的化合物，筛选了一个片段样成员库，以及结构复杂的半胱氨酸反应性化合物，以确定其对T细胞活化的抑制作用，从而鉴定了几种命中物，包括TMEM173 / STING的新型共价抑制剂和解旋酶ERCC3等。

蛋白质组范围的片段配体性图谱 – 超越抑制剂开发

基于蛋白质组全片段的配体发现不仅有助于鉴定直接改变蛋白质功能的化合物（例如，阻断酶活性或蛋白质-蛋白质相互作用），还可以鉴定结合蛋白质靶标而不直接影响其功能的配体。这种“沉默”配体有可能转化为可能在蛋白质靶标上产生替代结果的化合物。最近，基于片段的化学疗法策略已被用于鉴定沉默配体，这些配体可以加入异性双功能分子中以改变蛋白质稳态。

靶向蛋白降解（TPD）方法利用小分子诱导泛素蛋白酶体系统（UPS）的组分（如E3连接酶）与靶蛋白之间的接近，从而产生蛋白酶体介导的清除。TPD策略通常利用两种类型的小分子 - 分子胶，诱导与E3泛素连接酶和新底物形成三元复合物，以及称为蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）的异双功能分子，其将E3连接酶配体连接到靶标结合配体，导致诱导接近。尽管PROTACs在TPD中的应用已成为补充传统小分子疗法的有力策略，并且已被证明是阻断多种蛋白质功能的有效方法，它们的开发受到配体可用性的限制，配体可以诱导靶标和UPS系统之间的接近。具体来说，虽然人类基因组中有>600种预测的E3连接酶，但只有少数被发现能够支持TPD，大多数研究利用靶向Cereblon（CRBN）和von-Hippel Lindau（VHL）的E3底物识别元件的配体。

这些示例共同强调了广泛的化学分析方法与基于接近的化学探针结合使用时的效用。在这种情况下，我们设想这种化学疗法策略不仅有助于发现其他PTM酶的配体以选择基于邻近的分子，而且还有助于系统地发现具有挑战性的蛋白质靶标的小分子结合剂，以实现其选择性修饰。

结论

在这篇综述中，我们讨论了化学蛋白质组学领域的最新进展，这些进展使得在全球范围内发现蛋白质配体成为可能。具体来说，将从FBLD借用的原理与ABPP等强大的化学疗法相结合，可以直接在天然环境中对数千种蛋白质的片段样文库进行广泛的分析。这些方法不仅提供了蛋白质和蛋白质上位点的实验证据，这些蛋白质和位点能够与类药物小分子结合，而且还产生了一组多种配体，可以在各种应用中用作化学工具先导物。

我们已经重点介绍了一些例子，其中基于蛋白质组范围的片段的配体发现已被应用于开发一流的化学探针，用于技术上具有挑战性的靶标和缺乏清晰可筛选功能读数的蛋白质，以及最近采用此类方法来增强用于蛋白质降解剂或稳定剂的异性双功能分子的开发。此外，使用“化学学启用”的片段样化合物允许对相对较小的化学库进行表型筛选，其中命中化合物可以直接用于鉴定药理学相关靶标。尽管这种化学腐蚀组筛选策略为发现在其天然环境中靶向具有挑战性的蛋白质靶标的化合物提供了优势，但进展初始片段导致更有效和选择性的配体仍然是一个挑战。

片段命中通常具有低亲和力，并且是天然混杂的粘合剂，混淆了对其蛋白质组范围结合相互作用的解释并评估其结合位点的可处理性。为此，我们强调了立体化学定义文库在鉴定结合相互作用方面的效用，这些相互作用显示了对一种立体异构体的偏好，从而增加了所鉴定的相互作用具有特异性的信心。此外，基于MS的工作流程的有限通量限制了一旦发现初始片段命中，可以针对给定靶标筛选的化合物数量。在这方面，最近开发的将侦察片段转化为结合位点报告探针的筛选策略将大大加快优化工作，允许筛选更大的化学库以鉴定更高亲和力的化合物。我们设想，该领域的持续进步和应用将为人类生物学和治疗开发的研究提供有用的化学探针，并最终提供配体蛋白质组的完整图景。

参考文献：

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