怎么分析RNAseq(RNA-Seq归一化问题)

Posted 2023-05-26

篇首语：书籍是屹立在时间的汪洋大海中的灯塔本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了怎么分析RNAseq(RNA-Seq归一化问题)相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

怎么分析RNAseq(RNA-Seq归一化问题)

1.为什么要归一化

RNA-Seq比对到基因组之后，可让我们测量基因表达。测序步骤产生大量cDNA 片段序列，称为reads,每个read代表样品中某些RNA分子的一部分.然后，我们将每个read分配到一个isoforms，并计算每个isoforms(isoform：可以认为同一个基因的不同版本的蛋白)有多少个read。在所有其他条件都相同的情况下，isoforms越丰富，则来自该异构体的片段越可能被测序。因此，我们可以将read计数代表isoforms的丰度。

image.png

RNA-Seq在衡量基因表达水平时，若单纯以比对到基因上的reads数来计算表达量在统计学上是不合理的。影响因素有：
1.基因长度：需要基因长度来比较同一细胞内不同基因之间的表达。RNA-seq实验中众所周知的固有技术效果与基因长度有关：RNA（或cDNA）分子在测序之前先进行片段化，较长的转录本会比较短的转录本被剪切成更多的片段。因此，转录本的reads数不仅与其表达水平成正比，而且与其长度成正比。如下图，我们不能单纯的数比对到基因上的read数来比较表达量高低，需要考虑基因长度的影响。
这样来说，序列长的基因永远会被认为表达量较高，从而错误估计基因真正的表达量。为了消除基因长度产生的固有技术误差，在过去十年中，已针对RNA-seq数据开发了许多归一化方法，其中常用的有RPKM、TMM、RLE、upper quartile上四分位处理等。

image.png

2.测序深度（相当于测量几遍）: 需要测序深度来比较细胞之间的基因表达。在下面的示例中，每个基因在细胞2中的表达似乎都增加了一倍，但是这是细胞2具有两倍测序深度的结果。RNA-seq中的每个细胞都将具有与之关联的不同数量的读取。因此，要准确比较细胞之间的表达，有必要对测序深度进行标准化。

image.png

3.样品之间一些高度差异表达的基因，样品之间表达的基因数量不同或存在污染会影响某些类型的标准化方法。建议对RNA组成进行核算，以准确比较样品之间的表达，在进行差异表达分析时尤其重要。在此示例中，如果我们将每个样本除以计数总数进行归一化，则DE基因将大大扭曲计数，DE基因占据了样本A的大部分计数，但没有样本B的计数。样品A的大多数其他基因将被总数较大的数除，并且似乎比样品B中的那些相同基因的表达少。

image.png

所以需要对原始的表达矩阵进行标准化，去除掉测序深度和基因长度所带来的噪音。

2.常用归一化方法

1.CPM (counts per million)

数值概念：计算公式：CPM=C/N*1000000
设C为比对到geneA的read 数（read count ）,N为比对到所有基因的总read 数
用途：在某些情况下，只想了解每个基因被覆盖到的相对read数，而不希望对其做长度校正，就会使用这个指标。CPM 只对read count相对总read 数做了数量的均一化。如果想进行基因间表达量的比较，则不得不考虑基因长度的不同。如果进一步做长度的均一化，就得到了下面的RPKM.

2.RPKM:Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads

RPKM，全称为reads per kilobase per million mapped reads，指的是每一百万个map 上的reads 中，map到外显子的每1K个碱基上的read数。
一般来说，基因越长，读取的次数（深度）越多，自然其有效读数就越多。而RPKM 就是为了消除这两个干扰的因素。以更好的比较不同结果。
数值概念：计算公式：RPKM=(1000000C)/(NL/1000)
设C为比对到geneA的read 数（read count ）,N为比对到所有基因的总read 数，L为gene A的碱基数，RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达量的影响，计算得到的基因可直接用于比较不同样品间的基因表达差异
用途：用于与基因表达量相的后续分析，用于单端测序
计算步骤：
首先对总值数据进行标准化（当然正常来说map到的count 肯定不止这么多，这里只是除了10，但一般而言百万级的count 可以除一百万）