微量振荡器(酶联免疫吸附法检测饲料中黄曲霉毒素B1)

Posted 2023-05-26

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微量振荡器(酶联免疫吸附法检测饲料中黄曲霉毒素B1)

目前已知黄曲霉毒素B1分布广泛，是毒性、危害最大的天然毒素，黄曲霉毒素在高剂量时能够导致急性死亡，长时间、低剂量地摄入黄曲霉毒素会导致慢性中毒。黄曲霉毒素会破坏猪的消化酶活性，阻碍对基本营养物的吸收，降低饲料转化效率，造成猪体消化机能紊乱，食欲减退、营养不良、贫血、免疫抑制、增重减缓和生长发育停滞，黄曲霉毒素B1超标导致仔猪生产性能下降。

一、材料与方法

1、仪器与试剂

本次检测主要仪器有：上海三科仪器有限公司生产的318MC型酶标仪、苏微微生物研究有限公司生产的黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒、粉碎机、80-2台式低速离心机、往复式振荡器、恒温箱、恒温水浴锅、微量移液器（单道、8道各一把，校准认证）、125ml分液漏斗、100ml具塞锥形瓶、8cm短柄漏斗、15ml、2ml离心管、分析纯甲醇、甲醇水（1+1）等。

2、样品

本次检测样品由绵阳市畜牧兽医部门10月提供的在十五个乡（镇）饲料销售门市、养殖场抽取的20个仔（乳）猪饲料样品，涉及20个品牌（品种）饲料，类型有配合饲料和浓缩饲料，样品均在保质期内，覆盖面广有很强代表性。

3、方法

3.1 原理：本检测是利用固相酶联免疫吸附（ELISA）原理，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原，待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测黄曲霉毒素B1（AFB1）。

3.2制备待测样品液：按照GB/T 20195-2006进行试样的制备，颗粒饲料取80.0-100.0g样品粉碎成粉末状。配合饲料称取5.0g于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水（1+1）溶液，振荡15分钟过滤，弃去1/4初液后收集样品提取液。浓缩饲料称取10.0g于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水（1+1）溶液，振荡15分钟过滤，弃去1/4初液后收集滤液。

吸取10.0ml滤液于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻摇3分钟，静置分层，放出下层三氯甲烷层，经盛有5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4的快速定性滤纸过滤于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷冲洗过滤，最后再用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，650C水浴通风挥干。冷却后准确加入10.0ml甲醇水（1+1），将蒸发皿中凝结物充分溶解后提取为样品提取液。待全部样品液制成后，分别用A试剂将样品提取得进行适当稀释，即成待测样液。

3.3 试剂的制备：将测试盒于室温放置30分钟平衡（秋冬季需空调加温至250C左右，并预热酶标仪），首先对酶标抗原进行稀释，配制成酶标抗原溶液，再取3ml浓缩洗涤液进行10倍稀释待用。

3.4 设定1号孔为调零孔，2－7号孔为AFB1标准液对照孔，其余为样品孔。按照试剂盒要求对反应板进行两次洗板后，依次加入配制好的标准溶液与待测样液各50ul。1号孔加入酶标抗原稀释液，其余加入酶标抗原溶液50ul试剂，轻摇混匀，加反应盖膜后放入370C恒温培养箱温育30分钟。取出反应板5次洗板后加入显色剂，轻摇混匀放入恒温培养箱温育15分钟显色。取出反应板后加入终止液50ul，摇匀后用酶标测定仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。

二、、结果与判定

1、设横坐标为系列标准浓度的常用对数值（LgC），纵坐标为各系列标准液吸光度A值与0ng/ml标准液吸光度A值的比值（A/A0%）绘制标准曲线，得到线性公式y=-2.2457x+0.8592 R2=99.4，由此得到相应样品的浓度C的对数值lgC，求其反对数，得到待测样品的AFB1浓度C，按AFB1含量（ng/g）=C×V×D/M 进行计算各样品AFB1含量。[C：待测样液中AFB1含量（ug/ml）、V：样品提取液体积（ml）、M:样品质量（g）、D：样品稀释倍数]

2 、判定：从上表看，06-2012-05样品的AFB1含量为70.08 ug/kg，按照中华人民共和国[饲料卫生标准]GB/T 13078-2001中关于仔猪配合饲料及浓缩饲料AFB1≤10 ug/kg的强制标准判定，06-2012-05号样品AFB1超标，超标幅度达7倍以上，判定为不合格，其余19个样品（品牌）AFB1含量均低于10ug/kg，判定为合格。

三、分析与讨论：

1、本次检测的20个品牌（品种）乳（仔）猪饲料，是我市畜牧兽医部门在限定时间段内从十五个乡镇的饲料门市或养殖场中抽取，包括9个配合饲料和11个浓缩饲料，其中本地企业生产品牌有9个，外地品牌有11个，基本覆盖了这些乡（镇）销售、使用的仔猪饲料品牌，具有很强的代表性。同时也反映出目前乳（仔）猪饲料市场竞争激烈，养殖户可选择品种仍多，行业监管任务重。

2 、结果显示95%的样品黄曲霉毒素B1符合中华人民共和国[饲料卫生标准]GB/T13078-2001对AFB1的限量要求，传统优质品牌企业生产的仔（乳）猪饲料AFB1含量普遍很低，反映出优秀企业的品控管理良好。同时也发现一个样品AFB1严重超标，通过调查发现该企业内部品控不严，特别是近期原料价格较高，为控制成本，采购了一些本地产高水分玉米原料生产仔猪饲料，导致该批饲料产品AFB1超标。对此辖区行政管理部门已调查处理，要求相关企业整改。

作者：苟双