微生物负染色(病毒检测的那些事儿)

Posted 2023-05-26

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微生物负染色(病毒检测的那些事儿)

病毒是一种古老的、原始的微生物，关于病毒的起源曾有种种推测：可能类似于最原始的生命；可能是细菌退化而来；甚至可能来源于陨石或彗星等“不速之客”。虽然病毒在生物进化中地位并未确定，但是病毒一旦产生以后，也同其他生物一样，能够通过变异和自然选择而不断演化和进化。

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病毒的构成只有一个蛋白质外壳内部包裹着DNA或RNA形成的一段序列，简约的结构却并不简单。病毒是一种靠寄生在细胞内部才能存活和复制的微生物，病毒毕生的故事就像一部情节老套的连续剧，从寻找宿主开始、到入侵宿主和自我复制、宿主破裂病毒释放，到寻找下一任宿主，周而复始。病毒对宿主的选择还特别的挑剔，一般来说一种病毒只会寄生在一种或几种特定细胞内。

由于病毒入侵感染的细胞不同，因此进行病毒检测时样本取材的部位也不尽相同。例如乙肝病毒只寄生在肝脏细胞内，流感病毒只寄生在呼吸道的细胞内。而这次引起全球范围内流行的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）就大量存在下呼吸道粘膜和肺泡组织液中，对于感染初期的患者来说，如果仅从血液样本中是很难捕捉到新型冠状病毒的踪迹。

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对于人体来说，病毒是一个外来的“入侵者”，当病毒从破损的皮肤、粘膜、呼吸道、消化道等处入侵后，人体会产生一系列应激性的反应。病毒感染早期症状通常不是很明显，随着病毒不断复制，数目显著增加，会引起红肿、溃疡等局部炎症，随着病毒进一步增多，人体会通过咳嗽、腹泻、发热等向外排出病毒，抑制病毒复制，并激活体内免疫反应，对入侵的病毒进行全面灭杀。

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那么如何才能对病毒进行有效的快速检测呢？与细菌和寄生虫等不同，由于病毒颗粒小，很难通过光学显微镜直接观察，病毒载量高（通常大于10⁷个）时通过组织切片样本进行负染增强后，可使用电子显微镜观测,但是通常到了这个时候，病人的“含毒量”也已经很大了。现在更常用的病毒检测从方法学上主要分为核酸测定和免疫测定两大类。

在病毒感染早期，病毒数量很少，对于已知的病毒种类，核酸测定可以捕获到病毒核酸特定的序列，从而抓住病毒入侵的“蛛丝马迹”。但核酸检测本身有很多步骤，从制备样本开始，鼻拭子、咽拭子等样本比血液样本中含有更多杂质，成分也更加复杂，这些成分很多会抑制核酸检测试剂，降低检出率。因此需要去除杂质，将病毒的序列纯化提取。核酸样本储存和运输也是非常重要的环节，比如新冠病毒是RNA病毒，而RNA不稳定，非常容易降解，因此存储条件至关重要。这些步骤中出现任何一个问题都可能导致病毒核酸无法检出。

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免疫测定是一种间接检测方法，主要是寻找针对该病毒的特异性抗体，以检测抗体来代替直接检测病毒。举例来说，如果有人感染了麻疹病毒，且没有接种过疫苗，那么身体里就会产生针对麻疹病毒的抗体。同样，假设被新冠病毒感染，我们的身体也会产生针对新冠病毒的抗体。IgM是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，是机体抗感染的“先头部队”，在感染的初期起作用但维持时间短、消失快。一般在感染新冠肺炎后的7天，发病3天左右，血液中就会产生特异性IgM抗体。将IgM抗体检测和核酸检测互相印证，就可以极大提高新冠肺炎的诊断率。而IgG抗体则产生较晚，但维持时间长、消失慢、浓度高，可作为远期感染的指标。并且对于病毒治疗和疫苗研发的意义也非常重大。通过对恢复期患者血清中抗体提取和纯化，可以有望寻找到对病毒有明显抑制作用的“中和抗体”，这可以快速应用的临床危重症患者的治疗，也可以用于预防性疫苗的研发。

无论是核酸检测，还是抗体检测，都是“有的放矢”，对已知病毒进行检测。而高通量测序在病毒检测，尤其在新病毒发现和鉴定中发挥着大作用。对于未知病毒鉴定来说，首先需要完成病毒的分离和纯化，通过对未知病毒核酸序列进行测序和鉴定。通过对临床病毒基因组进行连续分析，就可以跟踪病毒随时间的突变，这对揭示病毒在时空中传播的偏好和特点，实时监控病毒在易感人群中的传播更为重要，也可以为公共卫生干预手段提供信息，让我们更好地知道病毒如何变异，如何传播，从而让我们更好地预测未来，并希望能预防病毒的进一步传播。

传统的检测方法是在实验室中对病毒标本进行核酸扩增、凝胶电泳、免疫荧光标记等分析，随着检测技术的不断发展，新的病毒检测技术在灵敏度和准确性方面进行了很大提升。例如数字PCR、杂交捕获免疫荧光、胶体金免疫分析、CRISPR（规律间隔成簇短回文重复序列）基因编辑技术、下一代测序等新技术不断发展。

快速、准确是检测中最重要的两个指标。目前发展前景最好的，是可便携式的快速检测技术，可以将病毒快速检测部署到医院甚至社区中。一体式的仪器可以在全封闭检测芯片完成核酸提取及检测，可适用于急诊、ICU、救护车、社区、家庭、火车站等环境下快速识别感染人群，这为病毒防控提供了更有力的武器。

参考文献：

1. 《病毒的起源与进化》（西）多明戈科学出版社 2009 ISBN 9787030243096

2. 《人体和细胞的故事》之病毒和免疫的战争孙涵蕴https://zhuanlan.zhihu.com/p/36727863

3. 呼吸道病毒多病原检测技术研究进展隋竑弢，王大燕，舒跃龙《病毒学报》2013年02期

来源：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所