微孔板恒温孵育器(动物源性食品中细菌的检测——金黄色葡萄球菌)

Posted 2023-05-26

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微孔板恒温孵育器(动物源性食品中细菌的检测——金黄色葡萄球菌)

金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，S.aureus）是一种重要病原菌，隶属于微球菌科Micrococcaceae）、葡萄球菌属（Staphyloccocus），在《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey’s manua lof systematic bacteriology）（2004））中金黄色葡萄球菌被分为19个种，能够引起多种严重感染，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒时有发生。据美国疾病控制与预防中心报告，在美国由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒病例数量居第二位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%，由此而造成的经济损失也相当惨重。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒暴发事件首推2000年日本“雪印奶粉”事件，该事件造成14000多人受感染。目前世界各国都把金黄色葡萄球菌列为食品卫生的法定检测项目。

1 病原学特征

典型的金黄色葡萄球菌为圆形，直径0.5～1.5μm，排列成葡萄串状，在浓汁或生长在液体培养基上的球菌常呈双球或短链排列。金黄色葡萄球菌无芽孢，无鞭毛，大多数无荚膜，有的形成荚膜或黏液层。革兰氏染色阳性，但衰老、死亡或被白细胞吞噬及耐青霉素的菌株呈阴性。

金黄色葡萄球菌对营养的要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37～40℃，最适生长pH7.4，在干燥环境下可存活数周，可在普通琼脂平板培养基和血琼脂平板培养基上生长，不能在麦康凯培养基上生长。在普通琼脂平板培养基上形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1～2mm，在血琼脂平板培养基上形成的菌落较大。血琼脂平板培养基上的菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%～15%氯化钠肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸而不产气。甲基红试验阳性，VP试验弱阳性。

2 流行病学

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，在空气、水、灰尘、人和动物的排泄物中均可找到。人和动物的鼻腔、咽喉、皮肤、肠道带菌率比较高，是造成该菌污染食品的重要来源。食品加工者的手不清洁也能成为常见的污染来源。葡萄球菌食物中毒多见于夏秋季节。适宜葡萄球菌繁殖和产生肠毒素的食品主要是动物源性食品和含淀粉的食品。

3 危害

金黄色葡萄球菌常引起两类疾病：一类是化脓性疾病。它是化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。另一类是毒素性疾病。如果污染的食品含有葡萄球菌肠毒素，还会发生食物中毒，表现为进食含肠毒素食物后1～6h即可出现症状，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻，大多数病人于数小时至1d内恢复。金黄色葡萄球菌的致病性主要取决于其产生的毒素和酶。

溶血毒素：是一种外毒素，分为α、β、γ、δ四种亚型，能破坏血小板，使白细胞等崩解，并能作用于血管壁的平滑肌细胞，使平滑肌收缩、麻痹、坏死，引起机体局部缺血和坏死。

凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入动物机体后，该酶使血液中的纤维蛋白凝固沉积于菌体表面，与菌体相交联，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。金黄色葡萄球菌形成的感染具有局部性的特点与凝固酶有关。

耐热核酸酶：由致病菌株产生，耐受高温，可作为检测致病菌株的重要指标。此酶能迅速分解核酸，利于病菌扩散。

肠毒素：可引起人类食物中毒，刺激呕吐中枢，表现呕吐并腹泻。

4 检验方法

4.1 细菌分离鉴定

（1）仪器与材料显微镜、恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平（感量0.1g）、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、注射器、pH计或精密pH试纸、接种环、L形涂布棒等。

（2）培养基和试剂 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤（BHI）、兔血浆、磷酸盐缓冲液、营养琼脂小斜面、革兰氏染色液、无菌生理盐水。

（3）操作步骤

样品的处理：称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。

增菌和分离培养：将上述样液于（36±1）℃培养18～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈浑浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈浑浊生长。

将上述培养物划线接种到Baird-Parker平板和血琼脂平板，血琼脂平板于（36±1）℃培养18～24h；Baird-Parker平板于（36±1）℃培养18～24h或45～48h。

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无浑浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙且干燥。

金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

革兰氏染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约0.5～1μm。

血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker平板或血琼脂平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂斜面上，于（36±1）℃培养18～24h。取新鲜兔血浆0.5mL置于小试管中，再加入BHI培养物0.2～0.3mL，振荡摇匀，置（36±1）℃温箱或水浴箱内，观察6h，每0.5h观察一次，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌标准菌株的肉汤培养物做对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

结果可疑时挑取营养琼脂斜面的菌落到5mLBHI中，于（36±1）℃培养18～48h，重复试验。

4.2PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片法

（1）原理 PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片是一种预先制备好的快速检验系统。它含有具有显色功能并经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌具有很强的选择性，并含有冷水可溶性胶。测试片上的紫红色菌落为金黄色葡萄球菌。当测试片上出现除紫红色以外的其他任何颜色（如黑色或蓝绿色），则必须使用确认反应片。此确认反应片含有显色剂和DNA。金黄色葡萄球菌产生的DNA酶会和反应片中的显色剂形成粉红色晕圈。

（2）设备和材料恒温培养箱[（36±1）℃]、均质器、pH计或精密pH试纸、放大镜或（和）菌落计数器。

（3）培养基和试剂无菌生理盐水、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸、PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片、PetrifilmTM金黄色葡萄球菌确认反应片。

（4）检测步骤

样品制备：固体或半固体食品以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1∶10样品匀液。液体食品直接用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇制成1∶10样品匀液。

在无菌条件下将上述样品匀液的pH调为6.0～8.0对酸性样液用1mol/L氢氧化钠调节、碱性样液用1mol/L盐酸调节，备用。

接种：将上述制备好的样品匀液做10倍递增稀释，选择适宜的2～3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）接种PetrifilmTM测试片，每个稀释度接种2片，每片1mL。将测试片置于平坦表面处，揭开上层膜，用吸管吸取某一稀释度的1mL样液垂直滴加到一张测试片的中央处，然后将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生，切勿使上层膜直接落下，再把PetrifilmTM金黄色葡萄球菌测试片的压板放置在上层膜的中央处，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面上，拿起压板，静置至少1min使培养基凝固。

培养：将接种样液的测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，在（36±1℃条件下培养（24±2）h。

确认反应：如果测试片上没有菌落生长或菌落全部是紫红色（典型的金黄色葡萄球菌特征），无须进行确认；如果测试片上出现黑色、蓝绿色菌落或紫红色菌落不明显，需使用PetrifilmTM确认反应片做进一步确认。

将上层膜掀起，将确认反应片置入测试片的培养范围内，再将上层膜放下覆盖在确认反应片上，用手指滑动的方式轻轻将测试片与确认反应片压紧，包括确认反应片的边缘，此步骤可使测试片与PetrifilmTM确认反应片紧密接触并除去气泡，最后把插入确认反应片的测试片放在（36±1）℃条件下培养1～3h。

结果计算与报告：紫红色的菌落直接计数为金黄色葡萄球菌；需要使用确认反应片做确认时，计数有粉红色晕圈的菌落。没有粉红色晕圈的菌落不是金黄色葡萄球菌，不应被计数。如果整个培养面呈粉红色而没有明显的晕圈，说明金黄色葡萄球菌大量存在，结果记录为“多不可计”。

菌落计数。培养结束后立即计数，可目视或用菌落计数器来计数，放大镜可辅助计数；选取金黄色葡萄球菌菌落数在15～150个的测试片，计数菌落数，乘以相对应的稀释倍数报告之；如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15个，则计数稀释度最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之；如果最高稀释度的菌落数大于150个，计数最高稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之。报告单位以CFU/g（mL）表示。

4.3 ELISA方法检验金黄色葡萄球菌肠毒素

（1）原理本方法可用A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒完成。本方法测定的基础是ELISA。96孔酶标板的每一个微孔条的A～E孔分别包被了A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体，H孔为阳性质控，已包被混合型金黄色葡萄球菌肠毒素抗体，F和G孔为阴性质控，包被了非免疫动物的抗体。样品中如果有金黄色葡萄球菌肠毒素，游离的金黄色葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合，形成抗原抗体复合物，其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉；抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物（二抗）结合，未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉；加入酶底物和显色剂并孵育，酶标记物上的酶催化底物分解，使无色的显色剂变为蓝色；加入反应终止液可使颜色由蓝变黄，并终止了酶反应；以450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值，样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比。

（2）仪器和设备冰箱、恒温培养箱、振荡培养箱或普通培养箱、电子天平（0.01g）、均质器、离心机、离心管（50mL）、滤器（0.2μm）、微量加样器、微量多通道加样器、自动洗板机（可选择使用）、酶标仪。

（3）试剂和材料 A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒，pH试纸（3.5～8.0），025mol/L的三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH8.0），磷酸盐缓冲液（pH7.4），庚烷，10%次氯酸钠溶液，肠毒素产毒培养基，营养琼脂。

（4）检测步骤

从分离菌株培养物中检测金黄色葡萄球菌肠毒素方法：将待测菌株接种营养琼脂斜面（试管18mm×18mm），于37℃培养24h，用5mL生理盐水洗下菌落，倾入60mL产毒培养基中，37℃振荡培养48h，振速为100次/min，吸出菌液离心，8000r/min离心20min，100℃加热10min，取上清液，取100L稀释后的样液进行试验。

从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法：对于乳和乳粉样品，可将25g乳粉溶解到125mL0.25mol/L的Tris缓冲液（pH8.0）中，混匀后同液体乳一样按以下步骤制备。将乳于15℃下3500g离心10min。将表面形成的一层脂肪层移走，变成脱脂乳。用蒸馏水对其进行稀释（1∶20）。取100μL稀释后的样液进行试验。

对于脂肪含量不超过40%的食品，称取10g样品绞碎，加入pH7.4的PBS液15mL进行均质。振摇15min。于15℃下3500g离心10min。必要时，移去上面脂肪层。取上清液进行过滤除菌。取100μL的滤出液进行试验。

对于脂肪含量超过40%的食品，称取10g样品绞碎，加入pH7.4的PBS液15mL进行均质。振摇15min。于15℃下3500g离心10min。吸取5mL上层悬浮液，转移到另外一个离心管中，再加入5mL的庚烷，充分混匀5min。于15℃下3500g离心5min。将上部有机相（庚烷层）全部弃去，注意该过程中不要残留庚烷。将下部水相层进行过滤除菌。取100μL的滤出液进行试验。

其他食品可参考上述食品处理方法。

检测：所有操作均应在室温（20～25℃）下进行，A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用。测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头，用过的吸头及废液要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜。将所需数量的微孔条插入框架中（一个样品需要一个微孔条）。将样品液加入微孔条的A～G孔，每孔100μL。H孔加100μL的阳性对照，用手轻拍微孔板充分混匀，用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发，置室温下孵育1h。将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中，并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体。每孔用微量多通道加样器注入250μL的洗液，再倾倒掉并在吸水纸上拍干。重复以上洗板操作4次。本步骤也可由自动洗板机完成。每孔加入100μL的酶标抗体，用手轻拍微孔板充分混匀，置室温下孵育1h。重复洗板程序。加50μL的TMB底物和50μL的发色剂至每个微孔中，轻拍混匀，室温黑暗避光处孵育30min。加入100μL的2mol/L硫酸终止液，轻拍混匀，30min内用酶标仪在450nm波长条件下测量每个微孔溶液的OD值。

结果判定：样品OD值/阴性对照OD值，比值大于2为阳性，小于2为阴性。

4.4 PCR方法检测金黄色葡萄球菌

（1）原理以PCR技术为主的生物技术手段在金黄色葡萄球菌检测方面的应用，除了主要针对该菌的致病性基因外，近年来很多学者逐渐探索了一些很有种属特异性的鉴别基因，主要包括耐热核酸酶基因。耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌的特异性酶，通过检测该酶基因可以鉴定金黄色葡萄球菌，均有较好的专一性和准确性。田静等（2007）建立了用PCR方法快速检测牛奶、冰激凌及肉中的金黄色葡萄球菌，灵敏度为10CFU/g（mL），全部检测可在24h内完成。用该方法对人工污染金黄色葡萄球菌的牛奶样品进行检测，结果表明，牛奶中金黄色葡萄球菌量≥10CFU/mL时可通过6～8h增菌后检出。

（2）仪器设备 PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统，台式离心机。

（3）试剂根据金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因序列设计一对引物，扩增片段长度为279bp。上游引物序列：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′；下游引物序列：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′。

（4）操作步骤

检测样品模板DNA的制备：取10g（mL）样品，常规无菌处理后，加入90mL营养肉汤培养基中，37℃振荡过夜培养（16～20h）。取0.5mL培养液与1mL灭菌PBS（0.05mol/L，pH7.4）混合，9000r/min离心3min，沉淀用PBS洗涤3次，水洗1次，用05mL水重悬沉淀。沸水浴10min，迅速在冷水中冷却，8000r/min离心10min，取上清，即DNA模板溶液。

PCR扩增：反应体系为25μL：DNA模板4μL、引物（10μmol/L）各2μL、dNTP（25mmol/L）4μL、MgCL2（25mmol/L）3μL、10×PCRbuffer2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5μL。

PCR反应循环条件：94℃预变性5min，按照94℃变性1min、55℃退火45s、72℃延伸45s进行35个循环，最后72℃延伸5min。

结果检测：取5～10μLPCR扩增产物用含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统分析，观察显示出279bpDNA扩增条带的即可判定为金黄色葡萄球菌。