徕卡冰冻切片机开关(解吸电喷雾质谱成像(DESI-MSI)阐明板蓝根品质特征)

Posted 2023-05-26

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徕卡冰冻切片机开关(解吸电喷雾质谱成像(DESI-MSI)阐明板蓝根品质特征)

从古至今，中草药在疾病防治中发挥着积极作用，为世界各地的人类健康做出了重大贡献，其品质优劣直接影响临床作用。以板蓝根为例，传统的质量评价一般是根据其形态特征建立起来的，现代研究大多集中在化学成分的含量上，使得化学含量分析与经验鉴定的空间信息相分离。因此，将药材的质量特性和化学特征直接联系在一起的品质鉴定方法对于完善药材品质鉴别至关重要。

近日，国家药品监督管理局中国食品药品检定研究院聂黎行研究员等在《Frontiers in Plant Science》发表了题为《Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging Illustrates the Quality Characters of Isatidis Radix 》(doi: 10.3389/fpls.2022.897528)的研究论文，文章首次将解吸电喷雾电离源(DESI)与四极杆飞行时间质谱(Q-TOF/MS)相结合，揭示了板蓝根代谢物的空间分布，并进一步结合多元统计分析方法，确定板蓝根的潜在质量标志物，为中草药质量评价提供科学依据。

实验方法

样品制备

取板蓝根药材，从中部切取1 cm左右的小段，浸没于0.1 g/mL的明胶溶液，-20 °C冻实。包裹样品的明胶块，用少量OCT包埋剂小心固定于载物台（避免污染），采用Leica CM2050冰冻切片机制备冰冻切片。

切片条件

箱体温度：-20 °C
刀台温度：-18 °C
切片厚度：100 μm

切片用双面碳导电胶固定于载玻片，轻轻压平。每批样品制备2个切片，分别用于正、负离子模式扫描。

实验方法

采用Waters Xevo G2-XS Q-TOF质谱仪结合DESI 离子源进行质谱成像实验，并采用高分辨液质技术验证板蓝根中化合物的鉴定结果。

采集质量范围：m/z 50 - 1,200

毛细管电压：4.0 kV

喷雾溶剂：MeOH - H2O（95:5，含0.1%甲酸）

喷雾溶剂流速：2 μL/min

采集像素：80*80 μm

实验结果

板蓝根品质特征

收集不同产地、品相、商品规格的药材64批，从多个角度观察、比较板蓝根的性状和显微特征。结合文献和书籍考证提出板蓝根品质特征的判断依据：以质地、断面、木纤维束、淀粉粒为指标。确定优质板蓝根的性状特征为：体实，质硬而脆，断面粉性或油润；横切面显微特征为：木质部可见木纤维束，薄壁细胞内淀粉粒多见。按此标准评价，特征编号为4、6的板蓝根药材品质最佳，2次之，1、3、5较差(图1)。

图1. 板蓝根横切面性状特征(A)、显微特征(B)、木纤维束(C)和淀粉粒(D)。

板蓝根谢物的空间分布

通过DESI-Q-TOF/MS获得了板蓝根的代谢物谱，检测到多种代谢物，包括生物碱、含硫化合物、苯丙素、核苷、氨基酸、有机酸、黄酮类化合物、酚类、萜烯、糖类、肽和鞘脂等。借助板蓝根UNIFI数据库并参考同位素峰、参考标准、文献等以及LC-MS/MS数据对上述化合物进行鉴定，同时利用DESI-MSI 技术可视化不同种类代谢物在组织中的空间分布。例如板蓝根中最具特征的含硫化合物(R, S)-goitrin是药典含量测定指标（中国药典委员会，2020）。如图2所示，(R, S)-goitrin的正离子在韧皮部、皮层和木栓层显示出较高丰度。

图2. 板蓝根中有机酸、氨基酸、核苷和酚类等的空间成像图。

板蓝根横切面大致可分为皮部（包括韧皮部、皮层、木栓层）和木部（包括形成层和木质部）两部分。如图3所示，皮部中代谢物离子强度高于木部中的离子强度。而品质特征研究结果显示，质量较差的板蓝根药材横切面木部占比较高。

图3. DESI-MSI获得的板蓝根横截面的木部([1])和皮部([2])在正(A)负(B)电离模式下的质谱图。

DESI-MSI结合多元统计分析发现板蓝根潜在质量相关标志物

采用DESI-QTOF/MS对6组质量特征的板蓝根进行分析。将编号2、4、6的板蓝根归入第一组（品质优良）；编号1、3、5的板蓝根归入第2组（质量较差），建立了基于正负模式下DESI-MSI数据的OPLS-DA模型，用以阐明优劣样品之间的化学成分差异。结果发现，其中精氨酸、腺苷、腺嘌呤、前告依春/表前告依春、(R,S) - 告依春、直铁线莲宁B等在第1组样品中的强度显著高于第2组，这些成分可作为板蓝根的潜在质量相关标志物（图4）。

图4. DESI-MSI数据在正(A)和负(B)电离模式下OPLS-DA分析的得分图和S-plot图。

小结

解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)以其高通量、免标记、高灵敏和高分子特异性等特点广泛应用于中药质量控制、中药药理研究、中药炮制、中药化学和中药资源等领域，本实验以MSI为桥梁，从空间化学的角度探索了揭示板蓝根质量指标的新方法，其特有的空间分布信息作为其他传统研究手段的补充，为具有中国特色的中药产业发展和前沿科研工作提供了全新的研究工具，助力传统中药焕发新的生机与活力。