常用的生物检测技术(《ACS Nano》：基于水两相系统的数字生物测定片上富集系统)

Posted 2023-05-25

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常用的生物检测技术(《ACS Nano》：基于水两相系统的数字生物测定片上富集系统)

数字生物检测方法已经成为现代生活中常用的一种技术手段，可以有效提高目标物的检测效率，改善人们医疗或生活体验。东京大学Hiroyuki Noji教授团队开发了一种基于葡聚糖/聚乙二醇混合物(DEX/PEG ATPS)双水相体系的片上富集方法，用于数字生物测定。为了量化该系统的富集能力，作者对碱性磷酸酶(ALP)进行了数字生物测定。在用右旋蔗糖酶衍生的DEX结合域(DBD)对ALP分子进行基因标记后，与传统数字生物测定法相比，ALP分子在DEX液滴中富集了59倍。随后，进行了基于Cas13的SARS-CoV-2 RNA数字检测，以评估该系统的性能，以实现更实用的检测。该系统能够有效地在片上富集目标分子，提高数字生物分析的检测灵敏度，无需使用外部仪器或外部电源，适用于现场生物分析或便携式诊断测试。相关工作以“On-Chip Enrichment System for Digital Bioassay Based on Aqueous Two-Phase System”为题于2022年12月29日发表在“ACS Nano”上。

作者使用了一个FRAD，显示一百万微米大小的反应堆(直径:4.4 μm;高度:3.2 μm)，用于制备飞升体积的均匀形状的DEX液滴。该反应器的尺寸足够小，可用于酶的快速数字测定，也足够大，可用于光学显微镜的定量成像；将DEX溶液最初注入位于底部的FRAD的流池中，用DEX溶液填充反应器。然后，将PEG溶液引入流池，用于冲洗多余的DEX溶液。因此，在PEG溶液下，FRAD的每个微型反应器中形成了富含DEX的液滴。FRAD反应器总容积与流道容积之比为1:125。因此，当PEG溶液引入流池时，系统中DEX的最终浓度降低到1/126。在本研究中，作者分别采用5.5% (w/w)和5.0% (w/w)作为DEX和PEG溶液的初始浓度，考虑到两个相互冲突的要求:足够高以诱导相分离，但又不能太高以保持中等粘度以重复处理溶液。作者测试了排列的DEX液滴富集DNA分子的能力。根据先前关于DEX/PEG体系的ATPS的报道，26个kbp长度的双链DNA分子有效富集在DEX-rich相。为了在该装置上测试这一现象，用5% (w/w) PEG将长度为48 kbp的λ-DNA分子引入流池中。DNA分子随时间高度富集，从而表现出类似于在试管中制备的富DEX相的高效富集。

图1 DEX液滴系统

作者研究了DEX液滴系统的可用性，用于大肠杆菌碱性磷酸酶(ALP)的标准数字生物测定。尽管DNA和RNA分子优先分配到富DEX阶段，但一些球状蛋白在富DEX阶段富集效率不高。为了高效富集EcALP，作者将EcALP与右旋糖酐蔗糖酶的DEX结合域(DBD)基因融合。DBD是一种相对较小的蛋白(14 kDa)，对右旋糖酐具有较高的亲和力(Kd: 2.79 × 10−9 M)。作者测量了DBD标记的EcALP (ALP-DBD)与在常规试管中形成的富DEX相的分布系数(DC)。将ALP-DBD以DEX 0.04% (w/w)/PEG 5.0% (w/w)混合在管中，离心分离出顶部的富PEG相和底部的富DEX相。然后，从每个相中抽取等分样品进行ALP浓度的测量。原则上DC被确定为CDEX/CPEG，其中CDEX和CPEG分别代表富DEX相和富PEG相中ALP-DBD的浓度。完好的EcALP的DC为1.9，而ALP-DBD的DC为385。尽管完整的EcALP在DEX-rich阶段略微容易被富集，但DBD标记将分区增强了大约203倍。这表明DBD能够使标记酶有效地分配到DEX-rich相。ALP-DBD分子在5.0% (w/w) PEG溶液中加标，然后引入流池覆盖DEX液滴。孵育10分钟后，引入油溶液密封DEX滴。为了进行比较，也进行了不含DEX液滴的测定。使用DEX液滴的数字生物测定显示，在不同浓度的ALP-DBD下，阳性反应器数量明显增加。虽然没有DEX滴的数据点在ALP-DBD浓度估计的理论线附近直线下降，但有DEX滴的数据点明显更高。与没有DEX液滴系统的测定相比，DEX液滴的最终富集因子为59。由此证实，DEX液滴系统在不需要任何外部仪器或外力的情况下，可以有效地富集DBD标记的蛋白质。

图2 利用DEX液滴系统进行EcALP的数字生物测定。

为了证明片上富集策略对非标记蛋白的可扩展性，作者开发了含有DBD, Ab-DBD标记抗体的DEX液滴系统。作为模型靶蛋白，使用β-半乳糖苷酶，一种同四聚体酶。将抗β-半乳糖苷酶的IgY分子用DBD标记生成Ab-DBD，并加载到DEX滴液中。β-半乳糖苷酶分子在聚乙二醇溶液中被加尖，用含氟底物注射到流池室中。孵育10 min后，用油封DEX滴，进行β-半乳糖苷酶的数字生物测定。为了进行比较，还进行了没有DEX液滴和/或Ab-DBD的数字生物测定。DEX液滴和Ab-DBD的最终富集因子为108，非常接近理论最大值125。该富集因子甚至高于DBD-ALP或DBD-Cas13实验中测定的富集因子。β-半乳糖苷酶与Ab-DBD配合物富集能力较强的原因是配合物中DBD数量较多，这将导致该配合物在富DEX相的分布系数高于ALP-DBD和Cas13-DBD，后者的DBD数量为2。该系统包括两个主要决定富集因子的因素：反应器总体积与流池体积的体积比和DBD标记蛋白的分布系数。虽然提高富集因子的直接策略是增加流池体积，但它会影响快速富集，因为富集过程取决于目标分子的扩散，其时间尺度与流池厚度的平方成正比。因此，串行缓冲区的引入将规避富集过程的指数扩展。更重要的是，提高DBD标记蛋白的分布系数是一种更有益的策略。除了将更多的DBD重复序列引入酶外，开发具有更高亲和力的DBD也可以被认为是有效的。然而，将蛋白质特异性富集到DEX液滴中需要通过基因融合或与DBD标记的蛋白质结合来标记DBD。相比之下，尽管DNA的富集不需要标记，但序列特异性富集是不可用的。此外，在富DEX相中功能被抑制或被抑制的分子难以在该体系中使用。

图3 利用Ab-DBD在片上用DEX液滴富集非标记酶。

总而言之，本研究建立了一种利用FRAD制备规则形状的DEX液滴的方法。为了避免液滴的自发融合，液滴通常被固化，从而降低了DEX液滴的流动性和内部水化作用，而这对于生物分子的富集至关重要。由于微流控系统制备的DEX液滴尺寸较大，基于酶活性的数字生物测定具有实际挑战性。考虑到DEX液滴从周围富含PEG的培养基中富集生物分子的固有能力，本研究进行了DNA、RNA和蛋白质的片上富集，随后进行了数字生物测定。在这些条件下，当蛋白质被DBD标记时，ALP分子和Cas13/RNA复合物的富集量达到30倍以上。因此，Cas13在数字RNA计数检测中实现了亚飞级的摩尔检测，而无需使用芯片外富集程序或使用磁系统或电极等外部设备的下拉方法。作者还开发了一种用于非标记蛋白的芯片上富集策略，使用预加载有DBD标记抗体的DEX液滴。结果表明，β-半乳糖苷酶的富集因子最高，为108。该实验证明了该系统对非标记蛋白的可扩展性。此外，作者还开发了双报告系统，以减少高灵敏度数字RNA计数Cas13蛋白检测的假阳性信号。双报告系统可识别的假阳性信号可能来自于样品或环境污染的非特异性核糖核酸酶。由于核糖核酸酶在生物样品中普遍存在，该方法将为各种类型的临床样品的数字RNA计数分析提供强大的支持。尽管如此，其余假阳性信号的来源尚不清楚，还需要进一步的调查。

文章来源：

https://doi.org/10.1021/acsnano.2c06007

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