高效絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化

Posted 2023-01-13 絮凝

篇首语：你应该小心一切假知识，它比无知更危险。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了高效絮凝剂产生菌的筛选及培养条件优化相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

微生物絮凝剂是一类由微生物或其分泌物产生的高效、无毒、能生物降解的水处理剂，它克服了常规的无机絮凝剂和有机絮凝剂对人体有害和产生二次污染的缺点.能产生絮凝性的微生物种类多，且具有广谱絮凝活性，因而具有广阔的应用前景.目前，生物絮凝剂研制的关键问题是成本过高，因此，筛选高效絮凝剂产生菌，提高絮凝活性，降低成本成为生物絮凝剂研究工作者的首要任务.笔者从活性污泥中分离出1株高效絮凝剂产生菌，命名为E-9，对它的培养条件进行了优化.
1 材料和方法
1.1 菌种及培养
基菌种来源：取自长沙市某污水处理厂活性污泥.培养基：
(1)筛选培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，抑真菌剂15～35μg，H2O1000mL，pH7.2；
(2)发酵培养基：葡萄糖20g，KH2PO42g，K2HPO45g，(NH4)2SO40.2g，NaCl0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，MgSO4.7H2O0.2g，H2O1000mL，pH7.5～8.5.
1.2 筛选模型的建立
根据国内外有关微生物絮凝剂方面的研究报道，综合本实?a href='http://www.baiven.com/baike/222/323577.html' target='_blank' style='color:#136ec2'>榈木咛迩榭觯杓屏艘韵律秆∧Ｐ停貉凡杉∈汀患嘌?a href='http://www.baiven.com/baike/223/303881.html' target='_blank' style='color:#136ec2'>平板划线→挑菌落→纯化培养→初筛→富集培养→复筛→高效絮凝剂产生菌.
1.3 筛选方法
根据建立的筛选模型，对采集的样品按以下方法进行筛选：将菌种样品稀释(10-1、10-2、…、10-6)后涂布于筛选培养基相应的平板，选择表面光滑且带粘性的单菌落作为纯菌种.然后用接种环将各单一菌种接种到装有40ml发酵培养液的200ml三角瓶中进行预发酵培养，温度设定为30℃，摇床转速为160r/min，18～24h后，按2.5%的接种量将预发酵培养液接种到发酵培养基中进行发酵培养72h(温度和摇床转速与预发酵同).通过测定各培养液的絮凝率进行初筛，对初筛获得的菌进行平行发酵培养，将絮凝率较高且稳定性较好的菌株作为复筛菌种.
1.4 絮凝剂样品的制备
将发酵液于12000r/min离心10min，取上清液作为絮凝剂样品.
1.5 絮凝率的测定
在100mL量筒中加入80mL蒸馏水，0.4g高岭土，5mL1%的CaCl2溶液，2mL絮凝剂样品，然后加蒸馏水至100mL，调节pH至7.0，溶液倒入150mL烧杯中，放在磁力搅拌器上快速搅拌1min，慢速搅拌3min，静置3min，用吸管吸取一定深度的液层于722型分光光度计550nm处测定吸光度，以不加发酵液的吸光度为对照来确定菌发酵液的絮凝程度.
絮凝率=(A-B)/A×100%
式中，A：对照上清液550nm处的吸光度；B：样品上清液550nm处的吸光度.
1.6 菌种鉴定
菌种经多次划线分离后，经革兰氏染色，显微镜观察到的菌体形态、大小、革兰氏阴性和阳性都一致后，可确定该菌为纯菌种，之后再进行生化实验，确定其属种，参照文献和进行.
1.7 絮凝剂产生菌培养条件的优化
以通用发酵培养基为基础，分别改变培养基中的碳源、氮源种类，碳源、氮源浓度以及初始pH值和培养温度，进行发酵培养，通过絮凝率的大小比较来判断培养条件是否得到优化.
2 结果与讨论
2.1 菌种的筛选
利用去菌体培养液对高岭土悬浊液絮凝实验为指标，筛选得到具有较强絮凝能力的微生物共9株，经复筛和传代培养，获1株絮凝活性较高且稳定性较好的菌株.2.2 菌种的鉴定菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上快速生长，且兼性厌氧，最适生长温度为37℃；菌落呈米黄色，较薄，中央略为凸起，表面光滑，粘度大；镜检时该菌为短杆状，革兰氏染色为阴性，苯丙氨脱氨酶试验阴性，吲哚试验阳性，M.R试验阳性，V-P试验阴性，H2S试验阴性，不液化明胶；不可利用柠檬酸盐，但能利用多种糖类和醇类，特别是能很好地利用乳糖；同时用伊红美兰乳糖培养基培养1～2d后，菌落在透射光下呈紫色，反射光下呈现绿色金属闪光，因而初步确定其为大肠杆菌.
2.3 碳源种类对絮凝活性的影响

在培养基(KH2PO42g，K2HPO45g，(NH4)2SO40.2g，NaCl0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，MgSO4.7H2O0.2g，H2O1000mL，pH7.5～8.0)中各加入2%的不同碳源，实验结果见图1.由图1可见，该菌可以蔗糖、葡萄糖、乳糖等多种糖类及甘油、乙醇等醇类为基质产生絮凝剂，且絮凝率都达到了90%以上，而对多糖类淀粉利用不好，其絮凝率仅为64.45%.在糖类中，蔗糖的价格较为便宜；而利用醇类，如乙醇，其絮凝率可达94.92%，且用它作为碳源，可免去灭菌的操作，降低成本，容易得到，容易处理，价格低廉，是较为满意的碳源替代品.
2.4 氮源种类对絮凝活性的影响
在培养基(葡萄糖20g，KH2PO42g，K2HPO45g，NaCl0.1g，MgSO4.7H2O0.2g，H2O1000mL，pH7.5～8.0)中各加入4%的不同氮源，实验结果见图2.

由图2可见，蛋白胨、大豆粉、复合氮源是该菌产生絮凝剂的良好氮源，说明该菌对植物有机氮源的利用较好，且大豆粉为氮源更利于该菌产生絮凝剂，絮凝率达到了98.87%，在工业应用中可以大豆粉代替复合氮源，且价格便宜，易得；同时由图2也可看出，无机氮源不利于该菌生长，也不利于絮凝剂的产出，这与文献报道相一致.
2.5 碳源浓度对絮凝活性的影响
以蔗糖代替通用发酵培养基中的葡萄糖进行实验，考察了不同蔗糖浓度对絮凝活性的影响，结果如图3所示.

由图3可知，蔗糖浓度为20g/L以下时，絮凝率与蔗糖浓度成正比，当蔗糖浓度达20g/L时，其絮凝率达到最大，为97.30%.当蔗糖浓度大于20g/L时，絮凝率随碳源浓度的变化不明显，还有下降的趋势，这可能是相对过量的碳源在微生物的生长和代谢过程中产生酸化，导致溶液pH值的下降，使微生物的生长和代谢受到抑制.
2.6 氮源浓度对絮凝活性的影响
以蔗糖(浓度为20g/L)为碳源，大豆粉为氮源，分别改变大豆粉浓度，结果如图4.由图4可知，当用大豆粉做氮源且浓度在7.5～20g/L时，测出的絮凝率较为稳定，基本上在97%～99.5%之间波动，这也是实验许可的误差范围之内.同时，从实验现象可以看出，自慢搅开始即有较大的絮体产生，由于旋流作用沉淀物迅速堆积在烧杯中央，并有结块的趋势；絮凝实验终了时，被处理液的上部极为透明，而且在实验时，当絮凝剂投加量为0.1%时，絮凝率就达98.42%，由此可以看出，用大豆粉作为氮源能有效地提高絮凝活性.
2.7 培养基初始pH值对絮凝活性的影响
考察了培养基初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下，pH对絮凝活性的影响如图5所示.

由图5可见，该菌的最适pH值为6.0～7.0，如pH=6.0时絮凝率为91.59%，pH为7.0时，絮凝率为94.27%，偏高或偏低均不利于该菌的生长和絮凝剂的合成，如pH为9.0时絮凝率仅为78.28%.2.8 培养温度对絮凝活性的影响图6显示了培养温度在25℃、30℃、35℃下的实验结果.由图6可知，该菌产絮凝剂的最佳培养温度为30℃，这与菌体最适生长温度不一致.
3 结论
a.筛选出1株絮凝活性较高且稳定性较好的细菌菌株E-9，初步鉴定其为大肠杆菌.
b.培养条件实验表明，该菌产生絮凝剂的适宜条件为：以蔗糖、乙醇为碳源，以大豆、蛋白胨为氮源，且当蔗糖与大豆达到最佳配比时，絮凝率达99.5%，初始pH值为6.0～7.0，培养温度为30℃.