微生物絮凝剂的研究进展

Posted 2023-01-13 微生物

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1 微生物絮凝剂的研究现状微生物絮凝剂是由微生物产生的有絮凝活性的代谢产物，主要由糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等组成。与无机盐类和有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂的突出特点是具有生物降解性，可消除二次污染，属于绿色环保产品。另外，微生物絮凝剂絮凝广泛，脱色效果独特。自美国科学家But-terfield从活性污泥中筛选出絮凝剂产生菌以来，微生物絮凝剂的研究逐步深入。特别是自20世纪70年代以来，韩国、日本等国家的学者对微生物絮凝剂进行了大量的研究，并取得了初步的研究成果[1，2]。R.Erythropolis所研制的絮凝剂已用于畜产废水处理，并收到良好效果。国内的微生物絮凝剂研究尚处于试验室阶段。
1976年，J.Nakamura等从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等菌种中筛选出19种具有絮凝能力的微生物，其中以酱油曲霉AJ7002产生的絮凝剂效果最好。1985年，H.Takagi等研究了拟青霉属微生物产生的絮凝剂PF101，它对枯草杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、血红细胞、活性污泥、纤维素粉、活性炭、硅藻土、氧化铝等有良好的絮凝效果。1986年，R.Kurane等利用红平红球菌研制出微生物絮凝剂NOC-1，它对大肠杆菌、酵母、泥浆水、河水、粉煤灰水、活性炭粉水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果，被认为是当时发现的最好的微生物絮凝剂。美国也研制出一些高絮凝性菌株，能与其他微生物一起制成生物活性液，用以快速消除下水道淤塞、水体富营养化和污泥膨胀等。至今发现的具有絮凝性的微生物种类有霉菌、细菌、放线菌和酵母菌。由它们生产的微生物絮凝剂类型很多，其中最具代表性的3种见表1。

一般来说，营养丰富的培养基有利于絮凝剂的产生，但各絮凝剂产生菌对营养的要求差别很大。红平红球菌S-1和260-2要求以葡萄糖、果糖为碳源，以尿素、硫酸铵为氮源，酵母膏和蛋白氨基酸对细胞的生长和絮凝剂的产生更为有利。后来，人们发现以乙醇为红平红球菌S-的惟一碳源时，发酵时间与以葡萄糖为碳源时基本相同，但其每细胞浓度的絮凝活性要高于以葡萄糖为碳源时的。寄生曲霉AHU-7165絮凝剂的积累要求培养基中含有一定量的酒石酸盐。拟青霉素菌SP-Ⅰ-1以淀粉为碳源，以酪蛋白的水解产物为氮源时有利于絮凝剂的产生，Ca2+尤其是CaO的浓度为0.01g/L时可极大地刺激菌体的生长和絮凝剂的产生。而絮凝剂产生菌S-4K可利用多种糖类为基质，但多糖类如淀粉则很难被利用。最佳氮源是KNO3而并非是常用的尿素。另外，接种量也影响絮凝剂的产生，过酸或过碱均不利于絮凝剂的产生，最适宜的pH值一般为中性到偏碱性，并且在培养的过程中，pH值存在先上升后下降的再稳定过程。最佳温度为25～30℃。通气量也会影响到絮凝剂的产生，过度曝气对红平红球菌的生长影响不大，但絮凝剂的产量却大为减少。
近几年，朝鲜、伊朗和日本等的研究者又发现了一些新的絮凝剂产生菌，具体见表2[7～9]。其中，芽孢杆菌AS-101所用的筛选培养基为：葡萄糖、聚蛋白胨、酵母膏、琼脂的含量分别为1，5，2，10g/L。其培养条件为：初始pH值7.0，25℃下培养2d。

絮凝剂DP-152产生菌所用的液体培养基的组成为每升水中葡萄糖、硝酸铵、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、四水合硫酸锰、氯化钠、碳酸钙、酵母膏、大豆胨及胰蛋白酶的含量分别为40.0，1.0，0.3，0.3，0.1，0.1，0.05，0.4，0.1，0.1，0.1g。其培养条件为：初始pH值7.0，30℃下培养3d。
絮凝剂A-99产生菌所用的液体培养基的组成为蔗糖、天冬氨酸、磷酸二氢钾及酵母膏的含量分别为1，5，0.4，0.1g/L。其培养条件为：初始pH值7.0，30℃下培养40h。
絮凝剂AS-101产生菌所用的液体培养基的组成为每升水中葡萄糖、磷酸氢钾、七水合硫酸镁、二水合氯化钙、氯化钠、硫酸铵、酵母膏、聚蛋白胨及琼脂的含量分别为2.0，1.0，0.2，0.7，0.1，2.0，10，5.0，3.0g。其培养条件为：初始pH值7.0，30℃下培养2～3d。
对比各种絮凝剂可知，利用芽孢杆菌生产的絮凝剂DP-152所含多糖与其他不同，其相对分子质量从几千到几百万不等，絮凝效果相对最佳。在絮凝实验中，絮凝剂的浓度仅为1μg/g，絮凝活性就可达到43%，并且可广泛应用于各种工业废水的处理。但未对絮凝剂的产量作考察，因此，无法对其工业化推广作经济预算。
我国微生物絮凝剂的研究起步较晚。见诸报道的只有从废水处理厂的废水中分离出的C-62菌株产生的絮凝剂、MF-3、MF-6、MF-8、HF-24絮凝剂以及利用Palcaligenes8724菌株生产的絮凝剂，其数量、品种都很少，难以实现工业化生产和应用。
2 微生物絮凝剂研究方法
(1)取样。从河流底泥、废水处理厂的废水、厨房下水道等地方采集富含絮凝剂产生菌的样品。
(2)样品的处理。取5g样品，溶于100mL装有无菌水的锥形瓶中，内放若干个玻璃小球，放入震荡器中充分震荡。取1mL溶液依次用无菌水稀释到106倍以上，放于冰箱中备用。
(3)接种到分离培养基中培养、分离。将处理后的样品用滴管接种到预先准备好的筛选培养基中(平板培养皿)，放于恒温培养箱中培养到预定时间，根据所产生的菌落的特征进行纯种菌的分离，用接种环接种到预先准备好的液体培养基中。接种方法为：接种环在菌落上刮取后，悬浮到10mL的灭菌水中，再取1mL接种到含300mL液体培养基的500mL锥形瓶中。
(4)纯种菌的液体培养。将接种好的液体培养基放于摇床中，培养到预定时间取出。
(5)培养液的絮凝实验。用高岭土悬浮液对培养液进行絮凝实验，挑选絮凝活性好的絮凝剂产生菌进行进一步培养。采用的方法为：将0.1mL10%的CaCl2溶液加到含有100mL浓度为5g/L的高岭土悬浮液的烧杯中，磁力搅拌1min(300r/min)，加入液体培养基(10μL/L)，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液将混合液的pH值调到7.0。快速搅拌(300r/min)30s，再缓慢搅拌(100r/min)1min，静置5min后可观察到粘性聚合体的产生。用UV-160A测定上清液的浊度，计算出其絮凝活性。
(6)培养条件的考察。对培养基的组成、温度、pH值、培养时间及代谢规律进行考察。采用3L发酵罐系统研究菌体的生长规律及其生长条件，并探讨培养基的再使用问题。絮凝剂产生菌的代谢产物可采用电泳法与紫外凝胶成像系统进行深入研究，对微生物絮凝剂进行提纯并评价其絮凝效果，探讨微生物代谢絮凝剂的机理，揭示微生物代谢絮凝剂的规律与途径。
(7)菌种的鉴定。根据分离培养后的形态特征和生理特征，对所产优良絮凝剂的菌种按照常见细菌系统鉴定手册进行鉴定。菌株的chemotaxonomical特性的分析方法见文献。
(8)代谢产物的分离精制和化学表征。用蒸馏水稀释得到的液体培养基，离心除去细胞，浓缩稀释的培养基，将2倍体积的冷乙醇加到该培养基中，将得到的沉淀在干燥箱中真空干燥过夜，得到絮凝剂粗品。然后，将500mg的粗品絮凝剂溶入100mL蒸馏水中，加入2%的氯化十六烷基吡咯(CPC)溶液，连续搅拌3～5h。将絮凝剂与CPC复合物经离心分离后得到的沉淀溶入0.5mol/L的NaCl溶液中，加入2倍体积的冷乙醇以得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀数次，将沉淀进行真空干燥，得到纯的絮凝剂。采用凝胶渗透色谱法测定纯絮凝剂的相对分子质量；利用元素分析仪分析其元素组成；采用FTIR测其IR光谱。
(9)培养液的工业应用。在250mL烧杯中，先加入200mL废水样品，再加入0.2mL10%的Ca-Cl2溶液作助絮凝剂，搅拌1min，将pH值调节到絮凝剂形成所需值，加入培养液使其浓度达到10μg/g，快速搅拌(100r/min)1min，再缓慢搅拌(50r/min)2min，静置3min后，测定其化学需氧量(COD)和悬浮物含量(SS)。
3 存在的问题与市场前景
综合分析目前国内外微生物絮凝剂的研究现状可以发现存在以下问题：①研究过程中大都没有考虑培养基的成本和絮凝剂的产量，而这些因素与絮凝剂的絮凝活性一样影响微生物絮凝剂的工业化。②对一个确定的相对好的絮凝剂产生菌的代谢规律缺少深入研究，尤其是在对所需结构的絮凝剂的定向培养方面。③考察絮凝活性时，多用实验专用的高岭土悬浮液作为标准来衡量，而对不同类型的实际工业废水的应用研究不够。④微生物菌种的来源大都取自自然界，对优良絮凝剂产生菌的诱变育种和基因控制方面缺乏研究。
随着人们环保意识的不断加强，微生物絮凝剂的应用将会越来越广泛。絮凝剂最大的应用市场是油田三次采油废水的处理。目前，处理油田废水主要采用聚丙烯酰胺类絮凝剂，其单体对人体神经系统具有毒性，不可降解，并易溶于原油中不便分离，影响原油的质量。采用微生物絮凝剂可解决此类问题。另外，微生物絮凝剂在食品、医药和生物产品领域也有广阔的应用前景。
目前，推广应用的关键是应进一步降低微生物絮凝剂的生产成本。为此，今后的工作应主要集中在：①高产菌株的筛选和优良絮凝剂产生菌的诱变育种和基因控制；②改进培养条件，研制出低成本的培养源；③进行微生物絮凝剂的化学组成、理化性质及絮凝机理的研究。在新菌种培育筛选、酶制剂稳定性研究等方面取得可靠成果后，工业化生产及应用将会取得较大的突破。