微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性

Posted 2023-01-12 絮凝

篇首语：一艺之成，当尽毕生之力。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

采用常规的微生物学方法，从垃圾渗滤液中筛选到一株高效微生物絮凝剂产生菌LB1，根据其形态学和生理生化特征初步鉴定该菌株属于假单胞菌属，命名为Pseudonomassp.LB1。LB1所产微生物絮凝剂的絮凝特性的研究结果表明，LB1的最佳产絮凝时间为96h，所产絮凝活性物质主要是其生长过程中的胞外分泌物和细胞生长后期的次级代谢产物，菌体细胞本身具有一定的助凝作用。LB1所产絮凝剂最佳加样量为3%(体积分数V/V)；对pH的适应范围较宽，在4～10之间具有较高的絮凝活性，均大于75%；温度为25℃时絮凝率为86.3%，在25～60℃之间，絮凝率基本保持稳定；LB1所产絮凝剂对几种废水具有较好的絮凝效果。
絮凝在给水和排水中均发挥着不可缺少的重要作用，所应用的絮凝剂主要有传统的无机、有机絮凝剂及生物絮凝剂，前者由于具有价格低廉，絮凝效果好等优点，因而被广泛使用，但由于其对人类健康所形成的隐患使其应用越来越受到限制[1，2]。微生物絮凝剂是一种由微生物产生的具有絮凝活性的高分子化合物，具有絮凝沉降性能好、安全、无毒、无二次污染、易于生物降解等优点，不仅能快速絮凝、沉淀各种水中的悬浮颗粒、金属离子，而且在废水脱色、高浓度有机物去除等方面有独特效果[3～6]，是一类极具发展前景的环境友好型水处理剂。同时，由于能产生絮凝作用的微生物种类多、生长快、易于采取生物工程手段实现产业化[7，8]，因此，研究和开发微生物絮凝剂具有深远的现实意义和广阔的应用前景。
从垃圾渗滤液中筛选出一株高效微生物絮凝剂产生菌LB1，对其进行了初步的生理生化鉴定，并对LB1所产微生物絮凝剂的特性和实际应用进行了研究，以期为今后该微生物絮凝剂的系统性研究工作奠定初步的基础。
1 材料与方法
1.1 样品来源
含菌样品取自成都市长安垃圾填埋场的垃圾渗滤液。生活污水取自西南交通大学家属区下水道污水，泥浆废水、墨汁、黑色素溶液自配。配制方法为将上述废水搅拌均匀，静置10min取上层液体，以蒸馏水为空白对照，使用光程为10mm的比色皿，利用722N型分光光度计(上海精密科学仪器公司)在波长550nm下测定，使其吸光度OD550在1.25～1.35之间。
1.2 培养基
分离培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0～7.2。筛选培养基：葡萄糖30g，NaNO32.0g，KCl0.5g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水1000mL。
1.3 菌种的筛选
(1)菌种的分离：取垃圾渗滤液1mL，加入装有99mL生理盐水并加有玻璃珠的灭菌三角烧瓶内，在QYC-200型全温振荡摇床(上海福码实验设备公司)上，180r/min，振荡10min，使其形成均匀的菌悬液，用无菌水分别稀释至10-3、10-4和10-5，各取0.1mL稀释液加至含有分离培养基的平板上，30℃恒温培养48～120h，挑取单个菌落，反复划线分离得到纯菌种。
(2)菌种的筛选：将分离所得到的纯菌种分别接种到筛选培养基中，180r/min，30℃恒温振荡培养72h备用。于试管中加入pH为7，质量分数为0.4%300目的高岭土悬浊液10mL，再加入0.2mL1%的CaCl2溶液(质量分数)和0.2mL发酵液，振荡使其充分混匀后静置10min，在液面下2cm处取样，以不加发酵液的高岭土悬液为空白对照，测定其上清液的OD550，测定方法同1.1。根据发酵液的絮凝活性确定高产絮凝菌株，菌株的絮凝活性以絮凝率(η)表征[9，10]，计算公式如下：

式中：A0为空白对照OD550；A为测定管OD550。
1.4 细胞生长周期及产絮凝剂周期的测定
将微生物絮凝剂产生菌接种到筛选培养基中，于30℃、180r/min恒温振荡培养，每12h取混匀的菌悬液2mL，以未接种菌种的培养基作参比调零，测定培养液OD550，同时测定培养液对高岭土悬浊液的絮凝活性。
2 结果与讨论
2.1 菌种筛选和初步鉴定
经筛选得到的菌株LB1对高岭土悬浊液絮凝率为88.5%，多次传代培养后絮凝活性仍然高于80%，说明具有絮凝活性的遗传稳定性，适合进行后续研究工作。LB1的形态学特征：菌落不透明，圆形，隆起，边缘不整齐，表面湿润、光滑、有光泽、粘状液，为光滑型菌落；为革兰氏阴性杆菌，有荚膜和鞭毛，无芽孢，为严格好氧菌。生理生化反应为：氧化酶实验阳性；O/F实验为有氧氧化，产酸不产气；动力实验为阳性；精氨酸双水解酶、苯丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸均为阳性；硝酸盐、尿素和硫化氢实验阴性不液化明胶，不水解淀粉；能利用葡萄糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖，产酸不产气。根据上述形态学特征和生理生化反应，参照文献[11，12]，初步鉴定LB1属于假单胞菌属，命名为Pseudonomassp.LB1。
2.2 LB1的生长特性及产絮凝特性
将LB1接种到筛选培养基中，每12h测定其生长曲线及培养液对高岭土悬浊液的絮凝活性，以确定最佳产絮凝剂的时间以及菌体生长与产絮凝剂的关系，结果如图1所示。图1所示的生长曲线表明LB1于12h进入对数生长期，48h进入稳定期，60后其OD550逐渐降低，到96h下降明显；絮凝曲线表明，LB1经历了对数生长期至衰亡期的整个生长周期，LB1发酵液的絮凝率均逐渐增加，直至96h达到最大并基本趋于稳定，为90.6%，故其最佳产絮凝时间为96h。不同生长时期菌株LB1培养物的特点见图2。0～72hLB1的生长速度很快，培养液越来越浑浊，见图2a，至96h开始随着时间的推移LB1菌体逐渐粘附在一起形成细菌絮体，发酵液逐渐变得澄清透明(图2b和图2c)，说明LB1在生长过程中会形成多糖-蛋白质复合物及氨基酸聚合物等粘液状物质，使LB1逐渐粘附在一起，从而导致OD550随着培养时间的延长而逐渐降低。

为研究LB1所产絮凝剂的活性分布，将LB196h的发酵液离心，用生理盐水将LB1菌体细胞洗涤3次，最后稀释成菌悬液，分别测定发酵液、上清液和菌悬液对高岭土悬浊液的絮凝能力，以确定LB1所产絮凝剂的絮凝活性分布，结果如图3所示。

由图3可知，LB1所产絮凝剂的絮凝活性约91.8%存在于上清液中，上清液的絮凝活性远高于沉淀物的絮凝活性。上述结果表明，微生物絮凝剂的形成与产絮凝剂微生物的代谢活动密切相关，LB1经过对数生长期直至衰亡期均在不断产絮凝剂，伴随着进入衰亡期后细胞的裂解和自溶释放出一些代谢产物到发酵液中，其所产生的絮凝剂逐渐增多，故LB1所产絮凝活性物质是微生物细胞在生长过程中的胞外分泌物和细胞生长后期的次级代谢产物[5，13]，菌体细胞本身也有一定的促进絮凝的作用，这和文献的报道有所不同，根据其生长过程中所产生的粘液状物质推断其所产生的絮凝剂成分含有多糖、多肽和蛋白质等。
2.3 LB1发酵液加样量对絮凝效果的影响
为研究LB1所产絮凝剂的最佳投加量，在10mL高岭土悬浊液中，分别按0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%和5%(体积分数V/V)的比例加入LB1培养液，振荡后静置10min，测定其絮凝率，结果如图4所示。

图4表明，LB1对高岭土悬浊液的絮凝效果与菌液的投加量关系显著，投加量从0～3%，絮凝率与菌液投加量成比例递增，在投加量为3%时絮凝效果最佳，絮凝率为89.8%，但投加量继续增大，絮凝率反而降低。说明LB1所产微生物絮凝剂的最佳用量为3%，低于或者超过这个用量絮凝效果都会下降。这是因为在一定范围内增加絮凝剂用量，能使胶体失去稳定状态，改变其物理化学性质，形成絮凝体从水溶液中分离出来，当絮凝剂过量时会使所形成的絮体重新变成稳定的胶体，使得絮凝效果反而会下降。
2.4 温度和pH对絮凝效果的影响
温度及pH的变化对LB1所产微生物絮凝剂絮凝效果的影响如图5所示。

絮凝温度是影响絮凝反应、絮体成长和沉降分离等的重要因素之一。图5显示，温度从4℃到25℃，随着温度升高，微生物絮凝剂的絮凝率逐渐增加，且絮体增大，在25℃时为86.3%，从25℃增加至60℃，絮凝率基本保持稳定。这是因为温度过低时水的粘度大，对絮凝体的撕裂作用增加，絮凝体变得细小不易分离，而使絮凝率降低；当温度升高时，分子的运动和化学反应速度加快，水溶液粘度下降，凝聚分子扩散速度增加，絮体成长速度加快，促进了絮凝和沉降，从而加速了微生物絮凝剂的絮凝效果。LB1所产絮凝剂对pH的适应范围较宽，在4～10之间具有较高的絮凝活性，均大于75%，因此，LB1所产微生物絮凝剂的应用不仅可以解决一般絮凝剂造成的二次污染问题，还可解决目前广泛使用的无机和有机高分子絮凝剂pH值适用范围较窄的问题，这对于其实际应用有一定意义。
2.5 LB1所产絮凝剂的应用
以生活污水、泥浆水、墨汁和黑色素溶液等为研究对象，对LB1的实际应用进行了研究。分别在上述废水中按3%(体积分数V/V)的加样量加入LB1所产絮凝剂，并加入0.2mL1%的CaCl2溶液，测定其絮凝效果，结果如图6所示。

由图6可知，LB1所产絮凝剂对上述几种实际废水均具有较好的絮凝效果，絮凝率高于68.1%，处理后废水较澄清，尤其是对泥浆废水、黑色素溶液和墨汁的絮凝率均高于85.1%，且对于黑色素溶液和墨汁具有较好的脱色效果；此外，LB1生长过程中所产生的粘液状物质还对有机物有较强的吸附作用，有利于提高生物处理过程中活性污泥的性能；在LB1的实际应用中，加入CaCl2作为助凝剂，不仅能有效降低胶体的表面电荷，压缩双电层，使胶粒的表面性质发生改变而产生凝集作用，还因为Ca2+与胶体间的吸附作用，使胶体颗粒更容易被微生物絮凝剂吸附，有利于架桥作用，从而有效提高絮凝效果。
3 结论
(1)从垃圾渗滤液中筛选到了一株较好的絮凝剂产生菌LB1，其所产絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝率为88.5%，经初步鉴定该菌属于假单胞菌属(Pseudonomassp.LB1)。LB1所产絮凝剂最佳产絮凝时间为96h，对高凝土悬浊液的絮凝率达90.6%。LB1所产絮凝活性物质存在于发酵液中，是其生长过程中的胞外分泌物和细胞生长后期的次级代谢产物，菌体细胞本身具有一定的助凝作用。
(2)LB1所产絮凝剂最佳加样量为3%(体积分数V/V)；其对pH的适应范围较宽，在4～10之间具有较高的絮凝活性，均>75%；温度从4℃到25℃，随着温度升高，絮凝率逐渐增加，且絮体增大，25℃时为86.3%，在25～60℃，絮凝率基本保持稳定。
(3)LB1所产絮凝剂对几种实际废水具有较好的絮凝效果，说明菌株LB1具有较高的实际应用价值。