饮用水处理中剑水蚤携带细菌的研究

Posted 2023-01-12 细菌

篇首语：未知的事物总是被人以为奇妙无比。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了饮用水处理中剑水蚤携带细菌的研究相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

针对在我国饮用水系统中出现的剑水蚤类浮游动物，研究了其体表和体内携带微生物的行为及其变化规律.研究结果表明：浮游动物体表携带细菌的数量受环境细菌影响较大，随着环境细菌含量的变化，其波动明显，而体内细菌数量则相对稳定.体表细菌的数量还与水蚤个体有关，雌性水蚤体表细菌明显多于雄性水蚤体表细菌.由DGGE检测结果可见：体表细菌均来自于原水，而体内细菌则有可能有来自遗传的细菌，体内细菌的种类比体表细菌的多.
浮游动物穿透饮用水系统进入管网的事件导致饮用水安全受到威胁，文献[1-2]的研究表明，常规水处理工艺不能彻底去除水中的浮游生物；文献在韩国釜山等地的龙头水中发现了阿米巴虫；文献在罗斯托夫居民家中的龙头水中发现了线虫和阿米巴虫.在国内，随着活性炭深度处理工艺在水厂中的逐步推广和应用，研究人员在炭滤池中发现了水蚤类浮游动物的二次孳生现象，甚至引发多起剑水蚤进入供水管网的事故，导致饮用水的生物安全性受到威胁.有研究表明，浮游动物在进入输配水管网时，会携带大量细菌.文献在伍斯特的市政管网中捕捉到的无脊椎动物个体上，提取到大量细菌，如军团菌、沙门氏菌、志贺菌、耶尔森鼠疫杆菌等；文献研究表明：饮用水系统中浮游动物携带的细菌数量在10～4 000cfu/个体之间，包括可引起腹泻和可引起脑膜炎的细菌及其他致病菌或潜在致病菌；文献从取自北美某大城市管网水中的线虫上，培养得到大肠菌0～27cfu/个体.更为重要的是，虽然常用的饮用水消毒方法紫外和臭氧对自由细菌有较好的灭活作用，但是浮游动物携带的细菌却能在这种消毒环境下至少存活3d，即使浮游动物死亡，其危害依然存在，它能作为细菌等微生物的载体，增大微生物在管网中二次繁殖的可能性，威胁用户的饮水安全.综上所述，浮游动物及其携带的细菌对饮用水安全造成了威胁，因此对其的研究成为了国内外学者关注的焦点.国外对这个问题的研究开始较早，研究对象以线虫和阿米巴虫为主，但对于国内饮用水系统中出现的以剑水蚤为代表的浮游动物的相关研究还未见报道.
近年来，16SrDNA分子指纹图谱技术发展迅速，已成为研究环境微生物的一种新手段，其中，PCR-DGGE技术被广泛用于各种环境下的微生物群落结构分析[12-15].本研究以取自某水厂沉淀池的剑水蚤为研究对像，采用国标对剑水蚤携带的细菌进行培养，并用PCR-DGGE技术研究剑水蚤体表、体内细菌的数量和丰度与环境细菌之间的关系.
1 实验材料与方法
根据国内水源水及水厂中出现的浮游动物种类，选用剑水蚤(以下简称水蚤)类浮游动物作为研究对象，实验中所使用的器具均经过高压灭菌处理，实验在无菌间和超净工作台进行，使用的无菌水为经过灭菌处理后的超滤水.
1.1 体表与体内细菌检测
为了对比水蚤体表、体内携带的细菌与环境细菌之间的关系，分别从细菌含量为2 400cfu/mL，1 084cfu/mL，934cfu/mL(原水1，原水2，原水3)的水中选取剑水蚤，提取其体内、体表细菌进行培养计数(计数仪由迅数提供)，结果如图1所示.

为了研究同种水环境下，水蚤个体对体内细菌的影响，从细菌含量为1 560cfu/mL的原水中选取9组水蚤，每组各含10只水蚤.9组样品培养环境无差别，细菌提取方法无差别，为一组平行样，结果如图2所示.

为了研究同种水环境下，水蚤个体对体表细菌的影响，从细菌含量为2 860cfu/mL的原水中捕获9组水蚤，每组各含10只水蚤.9组样品培养环境无差别，细菌提取方法无差别，为一组平行样，结果如图3所示.

浮游动物体表细菌和体内细菌的测定方法参考文献，提取的细菌用于后续培养和PCRDGGE实验，进行细菌群落结构分析.
将提取的细菌混合液(0.1mL)，用琼脂培养基37℃培养24h，用菌落计数仪观察计数(同时做5个平行样).
1.2 细菌组DNA提取
用细菌基因组提取试剂盒提取实验获得的细菌样品，分别得到50μL的DNA模板，用于后续PCR-DGGE实验.由上海捷瑞生物有限公司提供DNA提取试剂盒(GK1071 50Preps).
1.3 16SrDNA的PCR扩增
将得到的DNA模板进行PCR扩增，引物使用细菌V3区通用引物如下.518R：5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3.GC338F：5-CGC CCG GGG CGC GCC CCGGGG CGG GGC GGG GGC GCG GGG GGCCTA CGG GAG GCA GC AG-3.
PCR程序设定：95℃预变性5min，94℃变性，1min，65～55℃退火，每循环降低0.5℃，1min，72℃复性45s(共20次循环)；94℃变性，1min，55℃退火，1min，72℃复性45s(循环12次)；72℃延伸8min；4℃保存；共32次循环.
1.4 16SrDNA序列的DGGE分析
a.变性胶的制备：使用梯度胶制备装置，制备浓度为8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为35%～65%.
b.PCR样品加样：待胶完全凝固后，将制胶版放入装有1×TAE缓冲液的电泳装置中(电泳液已预热到60℃)，取PCR产物10μL，加5μL的6×lodding buffer混匀后加入点样孔.
c.电泳：在电泳液温度恒为60℃条件下，200V电泳5h后，用syber-GreenI染液避光胶染30min，用bio-rad成像仪拍照后进行细菌群落多样性分析.
2 实验结果与讨论
2.1 细菌菌落计数
从图1可以看出：水蚤体表携带的细菌数量与水环境细菌数量的相关性较强，水环境中细菌含量(称为自由细菌)越多，水蚤的体表细菌就越多，其数量随着自由细菌含量的变化波动幅度明显.然而，水蚤的体内细菌数量波动较小，与自由细菌含量相关性较弱.还可以看到：体表细菌数量总是大于体内细菌数量，却小于自由细菌数量.这说明体表相对体内更适合细菌的附着和生长，而这又印证了浮游动物和细菌的生物学特性与关系.浮游动物和细菌的关系包括：a.捕食关系，Hessen等的研究表明浮游动物通过捕食细菌来获得磷元素，浮游动物与细菌最常见的关系就是捕食关系；b.竞争关系；c.共生关系；d.偏害关系；e.寄生关系.但是浮游动物与细菌的关系并非一成不变，文献发现，浮游动物和细菌的关系，在捕食前后发生了变化：捕食前，它们是捕食关系；捕食后，则构成寄生关系.因为浮游动物的体内细菌大都存在于肠道中，所以体内细菌须要抵抗水蚤肠道的消化作用，生存条件相对恶劣，能够在这种条件下生存的细菌就少了许多.
本研究在提取体内细菌过程中，使用了自由氯含量10mg/L次氯酸钠溶液去除水蚤的体表细菌，接触10min后，体表细菌被灭活，而体内细菌仍然完好的存活，说明水蚤能够保护其体内细菌免受氯消毒的伤害.文献在关于桡足类浮游动物的喂养试验中发现，其粪便中含有大量的细菌，这说明体内细菌会随着浮游动物的新陈代谢作用而被排出体外.文献发现线虫在管网的压力下，会释放出细菌.由此可见：浮游动物体内细菌对饮用水安全造成的潜在威胁比体表细菌的更大.
由图2可见：在培养环境相同的条件下，水蚤体内细菌含量波动幅度较小，大部分含量在350～500cfu/个之间.推测原因是在水环境稳定的情况下，当水蚤体内的微生物达到平衡状态时，体内细菌含量将趋于稳定，当然个体间有差异，但是变化幅度仍在特定范围之内.这是因为水蚤的体内细菌是由水蚤捕食得到，它们是寄生或者共生关系，而这种关系较为稳定.
由图3可以看出：在水环境相同的条件下，水蚤体表细菌含量波动幅度较大，波动范围在1 500～2 500cfu/个之间，其数量差距可达1 000cfu/个水蚤，推测是由水蚤个体之间的差异造成的，因为此前没有将雌雄个体分开试验.据此设计一组区分试验，在同种原水中捕获8组水蚤，前4组为雄性水蚤，后4组为雌性水蚤，实验结果如表1所示，同种原水中雌雄个体的体表细菌含量差距较大，平均相差500cfu/个水蚤，造成这种差距的原因是雌性个体比雄性个体大，且结构更为复杂，体表褶皱较多，更适宜细菌附着和生长繁殖.虽然水蚤体表细菌的波动幅度较大，但是从图4可以看出，其波动的百分比与体内细菌非常接近，仅略大于体内细菌数量的波动百分比.这是因为在做两种细菌数量的对比时，采用各自的最大值作为基数值，所以在波动百分比相同的情况下，基数大的幅度就大一些，而体表细菌的基数(2 550cfu/个)就远大于体内细菌基数值(519cfu/个).

2.2 DGGE指纹图谱分析
为了分析水蚤体内细菌、体表细菌与自由细菌的关系，并进行细菌群落多样性分析，试验中对PCR产物进行了DGGE指纹图谱分析，结果如图5所示.

泳道1和2为分别从样品1和样品2中提取的体内细菌图谱，泳道3和泳道4分别为从样品1和样品2中提取的体表细菌图谱，泳道5为原水水样中的细菌图谱.泳道1和泳道2均含有2，3，5和6条带，且含量大致相同，说明这4种细菌稳定的存在于水蚤体内(每个条带代表一种细菌)；1和4条带单独存在于泳道1中，条带7单独存在于泳道2中，则说明体内细菌的种类因个体差异而不同.泳道3和4中条带基本一致，表明体表细菌种类大致相同；而亮度差距较大，则说明体表细菌在数量上存在差别.通过对比泳道3和4和泳道1和2，可以看到体表细菌与体内细菌的种类差别较大.原水细菌丰度最高(泳道5)，共有8条条带，泳道3和4中的条带均能在泳道5中找出，说明水蚤体表细菌均来源于环境细菌；但泳道5中的原水中的细菌并没有在泳道3和4中完全重现，说明体表环境并不适合所有细菌生长.泳道5与泳道1和2对比可知：大部分条带相同，但是泳道1和2中含有的条带6在泳道5中找不到，这说明体内细菌并非完全来自于当前的环境水体，它可能来自遗传，水厂环境甚至是自然环境中，在水蚤进入水处理系统前已存在于水蚤体内.而与这种细菌同种的环境细菌和体表细菌在水处理或者实验室培养过程中因不适应新环境而消失，但存在于水蚤体内的这种细菌却仍能生长繁殖，成为优势种群，说明水蚤可为体内细菌提供庇护，使其免受外界不良因素的影响，如混凝、消毒等，因此体内细菌的控制应是今后研究工作的重点之一.此外，从图5的UPMGA聚类分析图可知：代表体表细菌的泳道3和泳道4菌群相似度为82%，为相似度最高的菌群，说明体表细菌的群落结构最为接近；而体内细菌相似率很小，只有50%，说明体内环境对于细菌的选择性跟个体关系有关，差距较大.
3 讨论
a.浮游动物所携带的细菌尤其是其体内细菌对消毒具有较大的抗性.优化水处理工艺系统，提高净化效能，杜绝浮游动物在滤后水中出现，保障饮用水水质达标，这是解决该问题的必要措施.
b.剑水蚤的体内体表携带大量的细菌，其总体数量至少在1 000cfu/水蚤以上，其中体表细菌数量较多，且受水环境影响较大，原水中细菌含量越高，体表细菌含量就越高.并且，因为雌性水蚤个体较大，其体表细菌比雄性水蚤的多.
c.体表细菌均来自于水环境，但是其优势种群在水蚤体表发生了变化，菌落结构较为简单.水蚤体内细菌含量较稳定，受水环境的影响较小，且其体内细菌的菌落结构较为复杂，大部分细菌来自于水环境，但也有少许细菌来源不明，其优势种群也发生了变化.
d.因为体内细菌受到水蚤保护，耐氯性增强数倍，所以体内细菌潜在危害性更大，应该对其抗药性的研究做进一步研究.