微生物絮凝剂产生菌菌种的培养及筛选

Posted 2023-01-12 絮凝

篇首语：知识贵在质，不在量。本文由小常识网(cha138.com)小编为大家整理，主要介绍了微生物絮凝剂产生菌菌种的培养及筛选相关的知识，希望对你有一定的参考价值。

利用4种不同成分的培养基从活性污泥中共分离出39株菌株，通过考察培养条件最终在4种培养基中各筛选得到一株具有较高絮凝活性的菌株，分别命名为A11，B6，C5，D6；同时考察了絮凝剂用量及助凝剂CaCl2的投入量对絮凝效果的影响，结果表明：A11絮凝剂投加量在0.2mL，CaCl2用量在0.8mL；B6絮凝剂投加量在0.2mL，CaCl2用量在1.0mL；C5絮凝剂投加量在0.25mL，CaCl2用量在1.0mL；D6絮凝剂投加量在0.15mL，CaCl2用量在1.0mL；分别具有良好的絮凝效果。
近些年来，人们越来越关注水处理剂的发展。作为现代生物技术产品微生物絮凝剂也受到研究者的关注，其中关于产絮菌种的培养以及如何获得高效的菌株尤为重要。微生物絮凝剂，顾名思义就是利用微生物来获得絮凝剂。这些微生物广泛地存在于土壤、污泥中，通过现代生物技术方法对其进行培养、发酵、提取、纯化即可得到微生物絮凝剂。目前发现的絮凝剂的产生菌有50种之多，包括一些霉菌、细菌、放线菌等，正因为微生物存在范围广，资源丰富，菌种种类多，因此使得微生物絮凝剂具有很好的应用前景。我国对微生物絮凝剂的研究起步晚，多数还只处于实验室研究阶段，仅局限于对菌种的筛选和对培养条件优化方面的试验。胡玉平等从土壤和活性污泥中筛选得到两株高效菌种氮单胞菌T7和动胶菌N2，瞿广飞由絮凝剂产生菌MB6-3分泌的胞外高分子物质对石化废水处理后的絮凝率达到90%以上，说明该产生菌的分泌物具有良好的絮凝效果，秦芳玲从活性污泥中分离筛选出3株对高岭土悬浊液具有较好絮凝作用的絮凝剂产生菌，并得到了最佳培养条件。
通过对处理过的污泥用不同培养基进行培养，筛选出适合的培养基下培养的絮凝剂产生菌，经过复筛后对絮凝条件优化得到具有较高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌。
1.实验
1.1 材料与仪器
1)固体培养基
(1)培养基A：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂6g，水1L，pH 7.2～7.4；
(2)培养基B：NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，蔗糖30g，FeSO4.7H2O0.01g，琼脂8g，水1L，pH自然；
(3)培养基C：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，NaCl 0.5g，琼脂8g，pH 7.4～7.6；
(4)培养基D：KH2PO41g，MgSO4.7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂8g，水1L，pH自然。
2)斜面培养基斜面培养基A，B，C，D与固体培养基A，B，C，D的成分相同。
3)发酵(液体)培养基发酵培养基A，B，C，D与固体培养基A，B，C，D的成分相同，其中各培养基均不加琼脂。
4)高岭土悬浊液称取2g高岭土溶于1L的水中制成悬浊液。
5)CaCl2溶液称取2g无水氯化钙溶于200mL蒸馏水中制成1%的CaCl2溶液。
6)恒温培养箱；分光光度计；高压蒸汽灭菌锅；水浴恒温振荡器；超净工作台；数显酸度计；电灼热灭菌仪。
1.2 方法
1)样品梯度稀释用一洁净的烧杯称取污泥10g，加入90mL无菌水并用玻璃棒充分搅拌，静置20min，用移液枪移取上清液注入装有9mL无菌水的试管中充分混合均匀后，换枪头从此试管中吸取1mL溶液注入另一支装有9mL无菌水的试管中，依次制得10-1～10-6梯度稀释液。
2)接种在无菌操作台上用梯度稀释涂布平板法，用移液枪分别移取10-1～10-6稀释液各0.1mL在4个固体平板培养基A上，再用无菌的涂布棒涂布均匀。依次将培养基B、C、D也同上操作。把制好的培养基贴上标签倒置于30℃的恒温培养箱中观察现象。
3)分离培养菌种充分长出后挑选长势好，个体均匀，颜色鲜明的菌落在4种不同的固体培养基上进行划线分离培养。
4)纯化培养将划线分离后的菌种在超净工作台中接种于斜面培养基上，在30℃的恒温培养箱中纯化培养。待菌落长出后进行初筛，用接种环挑取一环转接到装有50mL发酵液的三角瓶中，在30℃，150r/min的摇床中发酵培养72h，取发酵液进行絮凝试验测定絮凝率。
5)发酵培养纯化培养后，将有絮凝活性的菌株在无菌操作台中用接种环一株接三瓶，接种后在30℃，150r/min的摇床中发酵培养72h，取菌液测光密度值，通过对絮凝率的计算进行复筛。
6)絮凝活性的检测考虑到检测的快速性和准确性，采用高岭土悬浊液在OD550值下进行絮凝活性的检测及计算。测定时在100mL的烧杯中依次加入50mL的高岭土悬浊液，2mL 1%的CaCl2溶液和1mL发酵液用玻璃棒充分搅拌后静置5min，用分光光度计测其上清液在550nm处的光密度值。同时以加入空白培养液的高岭土悬浊液作为对照。
将有絮凝活性的菌种复筛时，针对每一种发酵液，分别向6支装有10mL高岭土悬浊液的试管中加入不同体积的1%CaCl2溶液和发酵液用塞子塞好，将试管上下快速颠倒10次，再慢速颠倒10次，静置10min，取上清液测光密度值。按照公式
(1)进行絮凝率的计算
絮凝率=(A-B)/A×100%
(1)
式中，A为对照上清液的光密度值；B为样品上清液的光密度值。
2.结果与分析
2.1 菌种培养
每种培养基选择浓度为10-1、10-2、10-4、10-64种被稀释过的污泥上清液进行实验，通过不同培养基对不同浓度的稀释液进行培养，经过观察有39株菌种可以划线分离培养。因为恒温培养箱存在受热不均匀的情况导致培养基B(10-6)和培养基D(10-6)严重的缩水、干枯并且未能长出菌种。
培养基和培养周期不同长出菌的种类也不尽相同，这与一些研究者研究的菌产絮凝剂结论相同[9-11]。在培养基A的培养下菌种生长速度快，第1天已经开始有菌落长出，通过观察浓度为10-1、10-2、10-6样品稀释液培养后各长出3种外观形态不同的菌落，而浓度为10-4样品稀释液培养后长出5种外观形态不同的菌落；培养基B、C、D培养的菌种生长速度较培养基A培养的菌种生长速度慢，均在第2天长出不同的菌落，各菌的生长情况如表1所示。

2.2 分离纯化
经过培养共有39株菌落可进行分离。以2g/L的高岭土悬浊液作为絮凝对象，将分离培养后的菌种接入液体培养基中，单一菌种1株接1瓶，通过对絮凝率的测定选出具有絮凝活性的菌株进行纯化培养。
如表2所示，共有32株菌株在分离培养后具有絮凝活性，其中包括由培养基A培养的14株菌种，编号A1～A14，由培养基B培养的6株菌种，编号B1～B6，由C培养的6株菌种，编号C1～C6，由D培养的6株菌种，编号D1～D6。

通过对絮凝率的测定，将有絮凝活性且絮凝率在50%以上的菌株(培养基A11，培养基B6，培养基C5，培养基D6)分别转接到对应的固体培养基中纯化培养，待菌落长出后分别挑取菌接入液体培养基中摇床发酵培养。
2.3 发酵培养及絮凝条件
对于微生物絮凝剂来说，要取得最佳絮凝效果，需要有最佳的投加量。在低浓度范围内，絮凝效率随浓度的增大而提高，但在达到一定浓度后，再增大絮凝剂的浓度，絮凝效率反而下降。而助凝剂[12-13]的加入也能有效地提高微生物絮凝剂的絮凝活性，通过对32株菌中絮凝活性在50%以上的菌株进行1株接3瓶的发酵培养3d后，取上清液进行絮凝率的测定，最终在4种培养基中各得到1株絮凝活性较高的菌株。
由图1可知，高岭土悬浊液中未加入CaCl2溶液时的絮凝率只有19.32%，而加入CaCl2溶液时絮凝率逐渐上升，当钙离子加到0.8mL时絮凝率达到最大76.00%，所以CaCl2溶液的加入对絮凝效果有一定的影响，主要是通过2价阳离子压缩双电层的作?a href='http://www.baiven.com/baike/224/264703.html' target='_blank' style='color:#136ec2'>美刺岣咝跄Ч６ü谋渚和都恿咳范?.20mL为最佳投入量，絮凝率为78.71%。

由图2可知，培养基B培养的产絮菌种经发酵培养后，取上清液分别加入不同体积的菌液以及CaCl2溶液，确定菌液投入0.20mL时絮凝率最大为87.66%，而加入1%的CaCl2溶液1.0mL时絮凝率达到最高89.19%。

由图3可知，当采用CaCl2溶液作为助凝剂时，CaCl2溶液加入1.0mL时絮凝率达到最高92.8%。菌株发酵液投加量为0.05mL时，所测得絮凝率最低，其后随着发酵液投加量的增加，絮凝率逐渐上升，当投加量为0.25mL时达到最大絮凝率90.43%。实验时发现，当发酵液投加量大于0.30mL以后，所测絮凝率呈下降趋势。这是因为当发酵液投加量较少时，高分子絮凝剂所形成有效絮体的数量少或者形成絮体的粒径小，絮体数量少时使吸附架桥无法完成，絮体粒径小时无法克服自身浮力下沉而进一步卷扫其他粒子形成大絮体；当发酵液加入量过多时，可能使悬浮物达到一种新的互相排斥的电荷平衡状态，从而使处理效果变差。

由图4可知，当CaCl2溶液添加0.2mL时絮凝率为70.00%，改变添加量当添加1.0mL时絮凝率达到83.97%，继续添加到1.2mL时絮凝率下降到81.90%；而菌液投加量在0.15mL时，絮凝率达到82.11%，继续增加到0.30mL时絮凝率有所下降，因此CaCl2溶液在1.0mL，菌液投加量为0.15mL时絮凝效果最好。

3.结语
对于微生物絮凝剂产生菌的培养，实验中尝试采用不同的培养基进行培养，最终选出适合污泥中微生物生长的培养基C，絮凝率达到90%以上。初筛时，肉眼观察不同时间段菌种生长的外观形状和颜色确定每种培养基培养的菌种种类，对不一样的菌种进行划线分离；纯化培养做到每种培养基只得到单一的菌种进行复筛；复筛时，测定絮凝率得到絮凝活性较高的菌种，为下一步镜检菌种类别及微生物絮凝剂成分的分析做准备。对于絮凝条件的优化，实验尝试采用加入不同体积的发酵液和不同量的金属离子来确定絮凝率较高的菌种发酵液，通过实验对于不同培养基培养的菌种都选出了絮凝率最高的菌种，说明不同培养基培养的产絮菌种其絮凝条件是不同的，为下一步获得絮凝活性更高的菌种提供了依据。