《中国幽门螺杆菌研究》 幽门螺杆菌的临床与实验研究
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《中国幽门螺杆菌研究》 幽门螺杆菌的临床与实验研究
从Warren和Marshall在1983年报道从慢性活动性胃炎病人胃粘膜中成功地培养出螺旋形细菌以来，来自澳大利亚、英国、荷兰及我国不少研究结果均表明，该菌与慢性胃淡及消化性溃疡有密切关系，该菌为幽门螺杆菌（Helicobacter pylorides，简称Hp）。为了进一步研究Hp的致病性、分布及来源，我们对1000例内镜检查患者进行Hp微生物学及组织病理学检查，并对5只成年狗、10只分健康小白鼠及10只大白鼠进行有关Hp的实验研究，旨在评估人与其它动物胃粘膜中Hp阳性率、临率意义及与慢性胃病的关系。[b]1 材料和方法[/b]
1.1 临床研究
本研究对象为有化道症状进行内镜检查的1027例住院及门诊患者，经筛选后对1000例资料完整病例进行了统计，其中，男709例，女291例，年龄12岁～82岁，平均47.2岁，内镜或病理最后诊断为慢性浅表性胃炎518例，慢性萎缩性胃炎174例，胃溃疡56例、胃癌47例，胃息肉12例，十二指肠溃疡121例，十二指肠炎38例，食管炎28例，食管癌6例。病人禁食12h，清晨空腹按常规准备后进行内镜检查，内镜用洗必泰和乙醇消毒，活检钳用同样方法处理，每个病人除在病变部位活检外，均在胃窦距幽门2cm范围内取2～3个活检标本，分为两份，一份作细菌培养和双相快速诊断，另一份作组织病理学检查。
组织学检查 活检标本在10％甲醛溶液中固定，然后按常规步骤制做病理切片。所有活检病理切片均做苏木－伊红（HE）染色，126例同时做Warthin－Starth染色，部分病例还做了革兰染色及电镜观察，发现Hp者为阳性，否则为阴性。
微生物学检查 取新鲜标本一块，先在Hp选择性血脂平板涂抹，然后将该标本插入尿素酶快速诊断培养皿中，观察其反应，阳性者一般3min～15min即可在组织块周围出现红色反应环、反应环出现的快慢与大小和组织块内含菌量的多少成正比。尿素酶试验后，将原组织块取出放在作氧化酶测试的滤纸片上，3min～15min内组织粘膜部分变黑色者为阳性，表示有Hp存在，否则为阴性。组织块变黑的快慢也与Hp量成正比。我们称之为“双快试验”，Hp对双快试验均成阳性反应（双相阳性），有变形污染者尿素酶试验可呈阳性，而氧化酶试验阴性，假单胞菌属污染则尿素酶试验阴性，而氧化酶试验阳性，反以“双快试验”对Hp感染诊断有极重要的鉴别意义。用作细菌培养的平板置37℃微嗜氧环境或CO[XB]2[/XB]环境中培养3d～4d。细菌生长后，对菌落特征、生化反应、形态学研究及多种抗生素、中药的药敏试验等项指标进行观察。
1.2 动物实验
取5只成年健康狗，用硫苯妥钠静脉麻醉后进行纤维内镜观察，并从胃窦小弯距离门2cm取活检两块、胃体小弯活检两块、分别进行细菌学检查及病理组织学检查。活检之后，由活检孔道插塑料导管，向胃注入事先制作的新鲜纯Hp活菌液5ml（含菌数约为10[SB]8[/SB]/ml）结束检查之后动物隔离饲养，于第二周再灌5ml，第3，4，5，6，7，8周各作内镜检查一次并活检，标本处理同前。取健康大白鼠10只，其中两只处死后取其全胃，于胃窦体各剪两块标本分别进行细菌学检查及病理组织学检查。其它大白鼠均用胃管向胃内注入纯Hp菌液1ml（含菌数同上）、第2周再灌1ml，于第3，4，5，7周各处死两只，取出胃标本进行细菌学及病理组织学检查，方法同前。取健康小白鼠10只，用与大白鼠同样的方法进行实验。
[b]2 结果[/b]
2.1 临床研究
1000例各胃十二指肠疾病中微生物学不同方法的Hp检出率见表1。以十二指肠球部溃疡、十二指肠球炎及胃溃疡的检出率最高。快速诊断阳性而培养阴性者18例，快速诊断阴性而培养阳性者25例。一例尿素酶试验阳性而氧化酶鉴测为阴性，经细菌学鉴定为大量变形菌污染。126例病理组织学切片用不同染色方法的Hp检出率见表2，其中细菌学阳性、切片阴性者12例，细菌学阴性切片阳性者3例。有16例胃溃疡患者的胃标本同时取自胃窦距幽门2cm以内胃粘膜及胃溃疡组织，取自胃窦粘膜的标本中有10例Hp微生物学检查为阴性，取自溃疡组织的标本及2例阳性。10例胃癌患者胃窦粘膜标本中有6例Hp阳性，取自癌组织的标本无一例阳性，这表明Hp不易在溃疡及癌组织中存在。
表1 胃十二指肠疾患1000例Hp微生物学检出率
| 内镜诊断 | 尿素酶（％） | 氧化酶（％） | 培养（％） |
| 浅表性胃炎 | 244/518（47.1） | 243/518（46.9） | 127/305（41.6） |
| 萎缩性胃炎 | 72/174（41.4） | 72/174（41.4） | 72/158（45.6） |
| 胃溃疡 | 41/56（73.2） | 41/56（73.2） | 38/55（69.1） |
| 胃 癌 | 24/47（51.0） | 24/47（51.0） | 11/45（24.4） |
| 胃息肉 | 5/12（41.7.0） | 5/12（41.7.0） | 2/5（40.0） |
| 十二指肠溃疡 | 98/121（81.0） | 98/121（81） | 99/119（83.2） |
| 十二肠炎 | 30/38（78.9） | 30/38（78.9） | 20/38（73.7） |
| 食管癌 | 2/6（33.3） | 2/6（33.3） | |
| 食管炎 | 14/28（50.0） | 14/28（50.0） | 14/23（60.9） |
| 合 计 | 530/1000（53.0） | 529/100（52.9） | 391/748（52.3） |
表2 胃活检标本126例切片Hp阳性结果比较
| 内镜及病理诊断 | n | W－S染色 | HE染色 |
| 慢性浅表性胃炎 | 47 | 22（46.8） | 20（42.5） |
| 慢性萎缩性胃炎 | 18 | 6（33.3） | 5（27.8） |
| 胃 溃 疡 | 16 | 10（62.5） | 10（62.5） |
| 胃 癌 | 10 | 6（60.0） | 6（60.0） |
| 十二指肠球部溃疡 | 20 | 16（80.0） | 15（75.0） |
| 十二指肠炎 | 15 | 11（73.3） | 10（66.7） |
Hp为革兰阴性杆菌，菌体常呈现弯曲状、或呈S形，短螺旋形及海鸥展翼形。主要位于胃粘膜的胃粘液层下，常集居成团，电镜下观察菌体表面带有光滑外衣，菌体一端长有3～6根鞭毛，鞭毛末端有的呈球状。Hp为兼性厌氧菌，但属于微需氧范围。在无氧条件下不生长，氧含量超过5％时则发育不良甚至不能生长，该菌在27℃以下及42℃以上均不能生长，最适宜温度为37℃，并要求培养罐中保持较高湿度（相对湿度98％）。Hp在培养基上形成的菌落由于培养基营养价值不同而大小各异。在哥伦比亚琼脂上菌落较大，可达2mm左右，在其它培养基上均为1mm左右的小菌落，菌落为圆形，略平、光滑或稍暗淡、无色、半透明状、无粘性、有时可见有狭窄的模糊不清的溶血环，无特殊气味。本菌生化反应主要表现为尿素酶阳性、过氧化氢酶阳性，氧化酶阳性、磷酸酶阳性。不利用糖类、不分解马尿酸、靛基质和硝酸盐还原试验均为阴性。
Hp对多种抗生素均显示高度敏感染，其最小抑菌度为：氨苄青霉素0.5ml/L，amoxycillin0.25ml/L，红霉素0.25ml/L，青霉素1mg/L，四环素10g/L，庆大霉素10g/L，metronidzole5g/L，rimcthoprin2.5g/L，萘啶酸30g/L，但本菌对多粘菌素B、二性霉素、吡呱酸、万古霉素等耐药。对某些中药如黄柏、黄莲、黄芩等亦显示敏感。
2.1 动物实验
5只健康成年狗实验前内镜及活检病理组织学检查，胃粘膜基本正常，Hp尿素酶快速诊断培养及切片染色均为阴性。接种Hp1周后有3只狗内镜及活检胃粘膜有浅表胃炎症改变，切片W－S染色发现少数Hp、尿素酶及Hp培养亦为阳性反应，其中两只持续3周，一只3周以后胃粘膜炎症消失，Hp转阴。另两例灌注菌液前后内镜检查胃粘膜正常，Hp试验阴性。
10只大白鼠及10只小白鼠前后各阶段检查胃粘膜均基本正常，Hp检查阴性。
[b]3 讨论[/b]
本文材料显示兰州地区人群胃粘膜中Hp的检出率很高，与粘膜的病理组织学炎症和消化性溃疡密切相关，这些结果与国内外一些报道基本一致，尿素酶试验培养及组织学切片检查对Hp检出率几乎同样敏感。一般认为使用特殊的W－S染色是检查Hp的较好方法，细菌是紫色，很容易辨认，但操作烦琐费时。我们用HE染色达到了与前者几乎同样的效果，部分病人用革兰染色也能清楚显示Hp存在。对Hp的识别主要利用其形态学、生物学特片及特殊的生长环境。其生化反应主要表现在尿素酶及氧化酶双相阳性，但变形菌也可产生尿素酶，可呈尿素酶阳性反应，而氧化酶阴性。我们采用“双快试验”对于鉴别Hp与变形菌的污染，提供了一项新方法。
为了回答Hp究竟是胃部疾患的病原菌还是共生功生菌、机会菌的问题，近年来国内外临床工作者、病理学家和微生物学家密切配合进行了大量临床及实验研究，结果表明，胃内Hp的存在与胃粘膜炎症程度呈正相关，而相对正常胃粘膜、胃癌、萎缩性胃炎及肠化病人胃标本中Hp检出率很低。我们的动物实验表明，5只成年狗实验前胃粘膜正常，Hp阴性。在灌注Hp菌液1周后，有3只胃粘膜发生炎症改变，Hp检查阳性。其中两只持续3周、一只持续4周以后，胃粘膜相继恢复正常，Hp亦转为阴性，说明Hp对胃炎致病因素可能有关。10只大白鼠、10只小白鼠灌注菌液前后胃粘膜无明显改变，Hp检验阴性。是否Hp对啮齿类动物无致病性，值得进一步研究。
病理组织学染色观察，Hp主要位于胃窦粘膜的粘液层下，常聚集成团，在胃体食管及十二指肠粘膜中有时也发现少数Hp存在，但检出率远低于胃窦粘膜。观察结果还表明，在同一病例中胃窦粘膜Hp检查阳性，而溃疡及癌组织中Hp常为阴性，说明Hp不易在溃疡及组织存在。
相关参考
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